看板Biology
標 題Re: [問題] 請問一下transformation的事情
發信站KKCITY (Fri Apr 28 11:36:01 2006)
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※ 引述《[email protected] (.......................)》之銘言：
> 老闆叫我做pHIT60這個plasmid的transformation
> 結果做了兩禮拜都都沒做出來
> 把那個plasmid拿去跑膠check DNA是否正確
> 跑出來的結果也是正確的
> 因為protocol上說這個DNA對competent cell有毒性
> 所以要用JM109這個strain的competent cell
> 後來我也換那個strain來做也做不出來
> 我們老闆親自來做也做不出來
> 所以我想請問這裡的前輩們
> 有沒有人也用過這個plasmid來做transformation
> 是否可以指點迷津
JM109你用啥培養液去養? 啥溫度?
根據Invitrogen的FAQ, CMV promoter在原核生物仍然會有低背景表現,
如果DNA量夠多的話(i.e. micro gram等級), 可以找不擅長表現的strain,
(請搜尋Stratagene或Invitrogen, 關鍵詞toxic cloning)
也可以降低溫度, 選比較爛的培養液(細菌過太爽的話, 表現蛋白質較佳).
太閑的話, 可以在CMV promoter與後面的gene之間插一段prokaryotic
trascription terminator, 不會影響到在真核細胞的表現, 又可以抑制細菌中的毒性,
可以參看lucigen.com的clonesmart kit的說明書與vector序列.
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