※ 引述《hurp (LentiVirus)》之銘言： : ※ 引述《ginmol (儲備博士)》之銘言： : : 我有幾個有關western blot的問題想請教各位先進： : : 1. 一級抗體的稀釋溶液何種較佳？可使其能夠保存重複使用？ : 以Santa Cruz p53 DO-1 antibody為例, 我將ab 1:3000 泡在 1X TBST : with 0.05% Sodium Azide, 可加 4%奶粉. 存放及使用都是在4度C. 這一管東西, : 我平均一個禮拜用一次以上, 回收再用. 再沒有補加ab的情況下, : 目前已經邁向第三個月了. 效果依舊很利. : 要注意的是一抗跟二抗之間的wash要充分, 例如 1X TBST 15 min X 4 time. : 把Sodium Azide 充份洗去, 因為這東西好像會影響二抗HRP的活性. 一般來說脫脂牛奶不建議長時間重複使用 （也不是一定不行 就是不建議） 要重複使用的可以用 BSA + NGS 另外，HRP 的確不能碰 Sodium Azide 不過正常的 western 步驟應該都可以有效去除掉 1st Ab 中的 azide : : 2. 是否曾嘗試以微量反應體積覆蓋membrane的方式進行抗體抗原反應？ : 我是用小塑膠袋封裝membrane, 以mini gel的面積來說, 大約6~8 ml的 ab溶液. 小袋封裝可以作到 1-2 mL 吧 : 我同學是把membrane 裝進 50 ml試管, 也是加 6~8 ml的溶液. 放入摩天輪去轉 : : 3. 一般蛋白loading量約多少較為適當？ : mini-gel, 7.5 mm 厚. 我一般loading從 20 ~ 60 ug, 取決於你想看的protein本身 ^^? : 的量多不多. 這種事情真的很難講 以細胞的 lysate 為例，我的習慣是如果不知道適當濃度的話 先 load 一個 10cm dish 中的 1/100 看看 : : 4. AP與HRP系統，何者的訊號強度較高？ : 我個人偏好HRP, 雖然較不方便, 但訊息比較敏銳. 如果你用好一點的ECL kit, : 訊號會很強. Millipore (作超純水機 濾膜 PVDF 那家) 也有推自己家的 substrate 號稱好處是價錢便宜 敏感度又非常高 所以可以用更少的二抗 實際用起來的感覺 敏感度真的是高 可是未必是好事 抗體的用量跟反應時間都要重抓... 不然 background 會很糟糕 還有就是 Millipore 的產品感覺 "水水的" 不太好弄 -- 莫非定律: 到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上 補充定律: 拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw