※ 引述《[email protected] (死胖子超怕熱)》之銘言： : ※ 引述《[email protected] (perk yourself up)》之銘言： : : 因為想研究一個蛋白質的某個domain 的 modification : : 如何影響到另一個domain 的活性 : : 卻又不想使兩個domain 同時被 modify (兩個domain 都有modify 的位置) : : 而使用一般的chemical cross linker 會 nonspecific modification : : 其結合方式會不正確 結合方式與 native 的方式會不同 : : 請問板上諸大 : : 有沒有看過任何方法 : : 可以將兩個不同的蛋白質接在一起 : : 而非是經由 cloning 的方式 : : 且接在一起的方式分別為兩個蛋白質的N端跟C端的結合 : 將domain A與fish的gene做fusion : 將domain B與bait的gene做fusion : 然後將domain A-fish的部分先做modofication : 再將domain A-fish-M混在domain B-biat混和 : 觀察有M和沒M的結果是否有差異...... : 只是這樣透過一個中間物不知是否會對您的實驗需求有影響就是 : 看起來像yeast two hybrid XDDDDD : 不然就...利用chemical reagent做partial modification吧 : 控制chemical的濃度、反應pH、buffer,etc... : 印象中Cyanylation測disulfide bond的方式也是partial modification ^^" : (最近千面人很熱阿...XDDDD) 講仔細一點我們的構想 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray) 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰 因此 fusion 的辦法似乎是不可行 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者 DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5' 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端 ubiquitin 結合的機制好像也不適用 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain 也會任意的鍵結在一起 有沒有知道其他方式可以做的阿 還是這本身就是個很難的題目?... --

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