作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)
看板Biotech
標題Re: [問題] cloning & TA cloning
時間Fri Nov 17 22:17:28 2006
※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之銘言：
: ※ 引述《Katoh (人工智慧)》之銘言：
: : 版上的高手大家好 有問題想請教大家
: : 我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k)
: : 質體是pGEX-2TK(4.9k)
: : 這陣子做cloning試了好幾次
: : (兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後
: : 用gel extraction分別純化後在ligation 16hr)
: : 最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體
: 2.8k確實不好接....我上一個用了2個多月....很慘
: 我後來也是先進TA vector 再去切plasmid eluted...才成功的
: : 因此想改用TA cloning先接上去之後再切
: : 但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有
: : (分別是SmaI&EcoRI)
: : 跟vector上的切口還蠻接近的 不知道這樣會不會有影響
: : 還有一點請教大家
: : 就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口
: : GGATCCCCGGGAATTCATCG (黃色是SmaI 紅色是EcoRI)
: : CCTAGGGGCCCTTAAGTAGC (綠色的base兩個RE都有用到)
: : (不知道畫這樣看不看的懂)
: : 是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口
: : 所以後續ligation失敗
: 你的考量是正確的
: 我幫你查了一下EcoRI沒問題.....但SmaI 如果左右 兩個Base切兩小時的效率是10%
: 建議你先切SmaI heat inactivated後再切EcoRI啦
: : 謝謝大家
: : 順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢?
: : 問題有點多 真不好意思 再次感謝!
個人推薦invitrogene Topo啦.....不過貴一點
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