作者rangelovero ( L'Arc~en~Ciel)
看板Biotech
標題Re: [問題] 關於restriction enzyme digest
時間Fri Feb 22 20:52:52 2008
※ 引述《snowypuppy (啦啦啦....)》之銘言：
: 想請問大家
: 我現在用EcoR1及HindIII將vector及insert做RE digest
: 做ligation之後長出來的怎麼挑colony卻都是vector的size
: 懷疑是vector沒有切乾淨 (我是取5ug 切2小時) 之後做gel purify
從這裡看來應該是沒有被切開的vector直接轉到host
使得你後來挑到的點都是vector
5ug太多啦 不然你就分開切
NEB的enzyme通常是1ug DNA 加 1ul的酵素可在一小時內作用完成
一小時是平均值 會隨著酵素不同而改變
你使用的EcoR1及HindIII都還滿好切的啦 只是5ug真的有點大量
: 問題是兩個enzyme切下來的片段距離很小 只有20-30bp
: 使我無法在跑膠時確認是否切乾淨
: 不知道有沒有其他辦法可以確認
: 或是實驗步驟需要改進的地方 感謝大家!
那我建議你分開切了
切完其中一種再跑膠確認是否為原vector linear的大小
找到兩種酵素截切完全的最佳時間
如果是沒切乾淨 挖膠後ligation應該是一顆colony都沒
只要找到最佳截切時間 colony可是多到數不完
這絕對是個關鍵
祝你成功T^T
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◆ From: 140.112.74.19
1F：推 zyxz:再找一種酵素把不要的片段切成兩半 這樣就可以分開啦 02/24 23:35