作者cloneting (1ting)
看板Biotech
標題Re: [求救] 定序問題求救~~~~
時間Wed Mar 12 18:07:15 2008
※ 引述《rangelovero ( L'Arc~en~Ciel)》之銘言：
: ※ 引述《rvnkhlnomgtl (或許天堂也常日落)》之銘言：
: : 最近忙著定序的工作
: : 我們實驗室的習慣是,先PCR後跑電泳,再切下band送定序
: : 但不知道為什麼,電泳圖明明顯示清楚的條帶,我也保證切膠的過程與保存沒有問題
: : 但源資(定序公司)竟然送來的資料是全軍覆沒....讓我沒法接受
: : 打電話去公司說請我再重送一下...但大家也都知道taq的消耗量很大
: : (總共有39管)
: : 實在很不好意思拿著定序服務失敗的收據單給老闆簽名啊!!!!
: : 所以想請問大家...電泳圖能拍得出來並切下該條帶的膠送定序沒法定序的情況是
: : 有可能發生的嗎???
: : 另外想請問大家都是給哪一家定序的呢?
: : 明欣的風評如何呢?如果可以也順便給我報個價~~~謝謝~
: 我之前有過類似經驗
: PCR產物有兩三條BAND(當中包含我的目標大小)
: 所以很自然地就挖膠純化所要的片段
: 接著再進行TA CLONING→定序
: 不過不管作幾次就是無法 TA 成功 (平常 TA cloning 是很基本的工作)
: 於是退而求其次 直接將純化完的產物送定序
: 也就是跟你一樣的步驟 結果也跟你一樣 一堆雜訊 = =+
: 業務跟我說不要純化了 直接給他 PCR 產物
: (他說以他們的經驗來看 PCR 產物會比較好定)
: 雖然不相信 但也沒別的辦法了XD
: 結果還真的定出來囉
: 當然我不是建議你送 PCR 產物
: 只是想說如果純粹要確定是否有放出正確產物
: 那應該還有其他條路可走(像上面說的)
: 不過TA cloning 是最保險也最易定成功的方法
: 你也許可以試試！
可能是你給的primer不適合定序
定序機器限制 primer的Tm最好是50-55度
如果PCR出來兩三條band 不純化直接TA cloning
再去colony PCR去挑含有你要的目標片段會比較容易
我也曾先挖膠純化後在TA cloning 不知道為什麼做不出來
但如果不先純化 直接做幾乎都會成功
試試看吧
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◆ From: 140.112.74.19
1F：推 MrCAKE:很好奇 原po指的是"不純化" 還是"不切膠直接純化"? 03/12 22:36
2F：推 satasumi:以我們的經驗..直接送pcr產物會比較好處理 03/13 01:39
3F：推 MrCAKE:我是在想原p所言"不純化直接TA cloning"是什麼意思 03/13 12:17
4F：推 rvnkhlnomgtl:那個Primer我並不是第一次送哦~送了好幾次了,而且我 03/13 16:42
5F：→ rvnkhlnomgtl:來再送一批,定序結果是成功的....就是很無解的情況! 03/13 16:43
6F：推 rangelovero:不純化我想是指PCR產物不純化 直接取2 or 3uL去TA 03/13 16:48