作者pinrupony (pinrupony)
看板Biology
標題[問題] western作不出來!!快救救我呀...
時間Fri Apr 27 22:56:50 2012
【問題】：B-actin都難壓出來，壓出來超白的!!
蛋白質濃度是40 ug，蛋白質+sample loading dye加熱5分鐘，
跑膠的時間約45分鐘，室溫下，
轉漬時間2小時，200 mA，
1抗壓1小時，PBST洗15分鐘，2抗壓1小時，PBST洗20分鐘
然後用冷光儀壓片30秒一張，B-actin很淡不然就是沒有...
請大家幫我解決這個問題...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 123.205.139.35
1F：→ pinrupony:用的抗體是santa cruz,比例是1:1000 04/27 22:59
2F：→ pinrupony:2抗是invitrogen，比例是1:2000 04/27 23:00
3F：→ dota01:只有ACTIN有問題? 04/27 23:08
4F：→ jsi:可能蛋白質太多，ECL反應光了。冷光儀選擇5秒或更少照照看 04/27 23:27
5F：→ jsi:看你推文，抗體用得太濃可能也是問題，b-actin好的一抗可以用 04/27 23:30
6F：→ jsi:到1:10000，通常WB好的二抗1:5000以上不是問題。 04/27 23:34
7F：→ pinrupony:沒有..其他target也有這樣的問題..就有的時候壓得出來 04/28 01:44
8F：→ pinrupony:有的時候就是壓不出來...謝謝J大，我會試試看的!! 04/28 01:45
9F：→ teryit:sample保存太久? 04/28 11:14
10F：→ pinrupony:sample是4/11收的，快半個月吧 04/28 12:06
11F：推 vixen:沒圖沒真相, 轉漬後blocking前ponceau S染的膜來一張看看 04/29 13:16
12F：推 vixen:冷光儀是啥? CCD嗎? 那鏡頭的光圈是否可調大?另外一抗可過夜 04/29 13:19
13F：推 mindy7794:一抗overnight比較美.. 以前同樣條件就壓不出來嗎 04/29 23:00
14F：推 Ferry:santa cruz的抗體很爛 換millipore的吧 05/13 10:45
15F：推 lyu0001:跟別的實驗室借少量抗體做一次看看吧 05/17 15:39
16F：推 pjojpioh:一抗建議overnight, 並且不要使用milk作為一抗的buffer 05/26 23:25
17F：→ pjojpioh:二抗請問是mouse monopolyclone的嗎? 05/26 23:26