※ 引述《hita (JIN)》之銘言： : 想要請問抽RNA的先進 : 請問細胞收下來之後 要馬上就抽RNA 或是有什麼辦法能保存? : 因為有時候要收時間點 想要全部收完再一次抽RNA 轉cDNA : 加RNAlater冰 4度C http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_7020.pdf ? : 或是加了Trizol之後 冰-80!? 加Trizol裂細胞之後，-80度可以保存幾周沒問題 : 再加Trizol之前 我細胞是要先加入少量PBS(一般細胞用 無RNase-free)打散 : 還是可以先離心呈pellet狀後 去上清 再加入Trizol打散 : 怎麼樣做比較好!? 應該沒需要吧 我都是 把培養基吸掉，PBS洗一下，棄去 然後直接把Trizol加到培養皿裡 莫非你抽的是懸浮細胞？ : 那抽完RNA轉成cDNA後 : 要如何去訂cDNA濃度 測OD!? 沒法的啦，定量是在做RT之前 : 因為一直抽不好 : 我抽完RNA 測OD 260/280都有1.8以上 基本正常阿 和你用的溶解RNA的水有關系 小于1.65才不對 : 然後跑膠 : (沒有用特定的RNA gel, 只是用1% agar gel, 100mV, 8mins, 糊掉, : 沒有18S.28S分明的band) 其實不需要RNase free的膠，把電泳槽洗洗幹凈，換新的電泳液就可以了 除非你剛跑過大抽質粒的電泳，那會帶入很多RNase （我師妹就幹過這種事，抽出RNA跑電泳看，說全降解了，我看了一眼，槽很臟， 而且竟然用的回收重融的膠，新配一塊再跑一次就OK了） 我一般都用100V，跑15-20min，你的電壓不會太小？時間不會太短？ 另外，5S有看到嗎？ 如果是都降解掉了，5S那會一大陀 : 但還是硬著頭皮坐下去 取1ug的RNA 加DNase 然後再RT轉成cDNA : 轉完測OD 值都差不多 1ug~1.5ug (但裡面含有enzyme buffer...這個值不可信吧!?) 好像這一步沒人測OD的吧 : 然後PCR 使用GAPDH primer(約200bp) 35cycle 都有出來 GAPDH應該很容易拉出來才對，頂多25循環就飽和了，35cycle應該暴掉了 : 但P我自己基因的一般PCR primer(約500bp) 有的有 有的沒有(應該是要P到的) : 有加positive control 是OK的 : 我主要的目的是要做real time PCR : 但在抽RNA品質那麼不一糟糕的狀況下 實在不知道data.........@@ : 所以想要請問先進們的經驗 : 或是有什麼資料我可以去閱讀的 麻煩大家指點 謝謝 :> 如果有問題還是抽RNA的時候吧 仔細再看看Trizol的說明書 抽RNA的時候都要用RNase free的或是DEPC處理過的試劑、槍頭 另外一直要帶手套和口罩，手是RNase最大來源 還有不要用vortex，那樣打斷長的轉錄本 --

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