※ 引述《hita (JIN)》之铭言： : 想要请问抽RNA的先进 : 请问细胞收下来之後 要马上就抽RNA 或是有什麽办法能保存? : 因为有时候要收时间点 想要全部收完再一次抽RNA 转cDNA : 加RNAlater冰 4度C http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_7020.pdf ? : 或是加了Trizol之後 冰-80!? 加Trizol裂细胞之後，-80度可以保存几周没问题 : 再加Trizol之前 我细胞是要先加入少量PBS(一般细胞用 无RNase-free)打散 : 还是可以先离心呈pellet状後 去上清 再加入Trizol打散 : 怎麽样做比较好!? 应该没需要吧 我都是 把培养基吸掉，PBS洗一下，弃去 然後直接把Trizol加到培养皿里 莫非你抽的是悬浮细胞？ : 那抽完RNA转成cDNA後 : 要如何去订cDNA浓度 测OD!? 没法的啦，定量是在做RT之前 : 因为一直抽不好 : 我抽完RNA 测OD 260/280都有1.8以上 基本正常阿 和你用的溶解RNA的水有关系 小于1.65才不对 : 然後跑胶 : (没有用特定的RNA gel, 只是用1% agar gel, 100mV, 8mins, 糊掉, : 没有18S.28S分明的band) 其实不需要RNase free的胶，把电泳槽洗洗干净，换新的电泳液就可以了 除非你刚跑过大抽质粒的电泳，那会带入很多RNase （我师妹就干过这种事，抽出RNA跑电泳看，说全降解了，我看了一眼，槽很脏， 而且竟然用的回收重融的胶，新配一块再跑一次就OK了） 我一般都用100V，跑15-20min，你的电压不会太小？时间不会太短？ 另外，5S有看到吗？ 如果是都降解掉了，5S那会一大陀 : 但还是硬着头皮坐下去 取1ug的RNA 加DNase 然後再RT转成cDNA : 转完测OD 值都差不多 1ug~1.5ug (但里面含有enzyme buffer...这个值不可信吧!?) 好像这一步没人测OD的吧 : 然後PCR 使用GAPDH primer(约200bp) 35cycle 都有出来 GAPDH应该很容易拉出来才对，顶多25循环就饱和了，35cycle应该暴掉了 : 但P我自己基因的一般PCR primer(约500bp) 有的有 有的没有(应该是要P到的) : 有加positive control 是OK的 : 我主要的目的是要做real time PCR : 但在抽RNA品质那麽不一糟糕的状况下 实在不知道data.........@@ : 所以想要请问先进们的经验 : 或是有什麽资料我可以去阅读的 麻烦大家指点 谢谢 :> 如果有问题还是抽RNA的时候吧 仔细再看看Trizol的说明书 抽RNA的时候都要用RNase free的或是DEPC处理过的试剂、枪头 另外一直要带手套和口罩，手是RNase最大来源 还有不要用vortex，那样打断长的转录本 --

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