※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言： : ※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言： : : 標題的意思是做完IP然後再跑2D的 : : 最近作類似的實驗 : : 就是以streptavidin beads去抓有biotin lebel的DNA : : 以rehydration buffer將和此DNA結合的蛋白質elute出來 : : (跟IP原理很像吧) : : 作了幾次，elute出來的蛋白質都非常非常少 : : 我用一樣的作法跑普通SDS-PAGE時，有很多蛋白質，也有差異 : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : 可否請問 什麼作法?.. 就是DNA affinity precipitation assay(簡稱DAPA) DAPA做完後先跑一維SDS-PAGE看看差異 (loading時，連beads也給她load下去了) : : 但是要做2D時，蛋白質、DNA、beads的量全部加4倍 : : 照理說，應該看到的蛋白質要比1D多很多 : : 但是並沒有，還少很多! : : 我的作法是以離心收下beads : : wash=>將beads拿去煮10分鐘=>再加rehydration buffer : : =>取上清液(還剩大概60ul buffer沒取到，因為想避免取到beads) : : 此60 ul有拿去跑SDS-PAGE，結果"幾乎"沒東西! : : 難不成都還在beads裡嗎??怪了，都煮過了哩! : : (含有urea的溶液不能煮，所以才先煮beads) : : 因為用這個方法的人很少，IP的人比較多 : : 不過方法類似 : : 所以想請教做IP後再做2D的人有沒有此問題呢?如何解決哩? : : 謝謝~ : 看不大懂.. : 可否請問到底是 IP 沒東西還是 IP 完跑 2D 後東西不見了? 有東西，跑一維sds-page以銀染染色是可以看到蛋白質的 : 目的是否是要釣 transcription factor ? 是 : 如果是要釣 transcription factor : 為何會預期 PAGE 上看的到明顯的 band? 為什麼不會?當然會看到蛋白質不是嗎? o.O 有點不懂這裡的意思哩~ 應該是說wild type probe跟mutant probe比 有差異的點就是我要的蛋白質 : bead 上到底蛋白質多不多? (是沒 elute 下來還是根本極少蛋白質bind 在 bead上?) : (何不取一點 bead 直接跑 PAGE ?) : 且 IP 完跑 2D 的目的為何 ? 很多，我已經跑8% acrylamide 13 cm的PAGE了 雖說有差異但還是分不太開 為什麼用2D? 因為2D一來我自己會，第二可以分的比較開 (本來還想2D可以loading比較多的體積 蛋白質多，差異應該也多) beads我剛說了，有跑而且有蛋白質~~~ 再不行我看我先從1D著手好了 -- http://0rz.net/da0PG 我的相簿.... --

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