※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之铭言： : ※ 引述《aggaci (有气质的台客)》之铭言： : : 标题的意思是做完IP然後再跑2D的 : : 最近作类似的实验 : : 就是以streptavidin beads去抓有biotin lebel的DNA : : 以rehydration buffer将和此DNA结合的蛋白质elute出来 : : (跟IP原理很像吧) : : 作了几次，elute出来的蛋白质都非常非常少 : : 我用一样的作法跑普通SDS-PAGE时，有很多蛋白质，也有差异 : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : 可否请问 什麽作法?.. 就是DNA affinity precipitation assay(简称DAPA) DAPA做完後先跑一维SDS-PAGE看看差异 (loading时，连beads也给她load下去了) : : 但是要做2D时，蛋白质、DNA、beads的量全部加4倍 : : 照理说，应该看到的蛋白质要比1D多很多 : : 但是并没有，还少很多! : : 我的作法是以离心收下beads : : wash=>将beads拿去煮10分钟=>再加rehydration buffer : : =>取上清液(还剩大概60ul buffer没取到，因为想避免取到beads) : : 此60 ul有拿去跑SDS-PAGE，结果"几乎"没东西! : : 难不成都还在beads里吗??怪了，都煮过了哩! : : (含有urea的溶液不能煮，所以才先煮beads) : : 因为用这个方法的人很少，IP的人比较多 : : 不过方法类似 : : 所以想请教做IP後再做2D的人有没有此问题呢?如何解决哩? : : 谢谢~ : 看不大懂.. : 可否请问到底是 IP 没东西还是 IP 完跑 2D 後东西不见了? 有东西，跑一维sds-page以银染染色是可以看到蛋白质的 : 目的是否是要钓 transcription factor ? 是 : 如果是要钓 transcription factor : 为何会预期 PAGE 上看的到明显的 band? 为什麽不会?当然会看到蛋白质不是吗? o.O 有点不懂这里的意思哩~ 应该是说wild type probe跟mutant probe比 有差异的点就是我要的蛋白质 : bead 上到底蛋白质多不多? (是没 elute 下来还是根本极少蛋白质bind 在 bead上?) : (何不取一点 bead 直接跑 PAGE ?) : 且 IP 完跑 2D 的目的为何 ? 很多，我已经跑8% acrylamide 13 cm的PAGE了 虽说有差异但还是分不太开 为什麽用2D? 因为2D一来我自己会，第二可以分的比较开 (本来还想2D可以loading比较多的体积 蛋白质多，差异应该也多) beads我刚说了，有跑而且有蛋白质~~~ 再不行我看我先从1D着手好了 -- http://0rz.net/da0PG 我的相簿.... --

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