※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言： : : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : : 可否請問 什麼作法?.. : 就是DNA affinity precipitation assay(簡稱DAPA) : DAPA做完後先跑一維SDS-PAGE看看差異 : (loading時，連beads也給她load下去了) : : 看不大懂.. : : 可否請問到底是 IP 沒東西還是 IP 完跑 2D 後東西不見了? : 有東西，跑一維sds-page以銀染染色是可以看到蛋白質的 : : 目的是否是要釣 transcription factor ? : 是 : : 如果是要釣 transcription factor : : 為何會預期 PAGE 上看的到明顯的 band? : 為什麼不會?當然會看到蛋白質不是嗎? o.O 有點不懂這裡的意思哩~ : 應該是說wild type probe跟mutant probe比 : 有差異的點就是我要的蛋白質 感謝.. 由於之前說跑普通 PAGE 對我來說跳太快了 有點看不大懂 transcription factor 量隨著蛋白質的不同而有差 不過一般來說都算是少量的蛋白質 所以我不確定到底是本身量就太少 還是後續的問題 so bead 抓蛋白質這方面沒有問題 與蛋白質量上沒有問題 : : bead 上到底蛋白質多不多? (是沒 elute 下來還是根本極少蛋白質bind 在 bead上?) : : (何不取一點 bead 直接跑 PAGE ?) : : 且 IP 完跑 2D 的目的為何 ? : 很多，我已經跑8% acrylamide 13 cm的PAGE了 : 雖說有差異但還是分不太開 so 問題是rehydration buffer 無法將 target protein 自 bead 中 elute 下來了 try this protocol (查到的 ..只能嘗試看看) ref : http://www.bioclon.com/magnetic-streptavidin-beads.pdf 節錄自以上網站的 Protein or antibody To elute the bound biotinylated protein or antibody from BcMag.Streptavidin Magnetic Beads, add the appropriate amount of Elution Buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.5), incubate for 0.5-5 min at room temperature, collect the magnetic beads by the magnetic separator and transfer the supernatant to a fresh tube.Immediately neutralize the supernatant to pH 7.0 by adding 1/10 volume of Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0) DNA Long nucleic acids used as biotinylated probes are not recommended due to difficulty in elution. For short biotinylated oligos, user can try the following method: 1. To elute the bound biotinylated oligo from BcMag.Streptavidin Magnetic Beads, add appropriate amount of ElutionBuffer (10 mM EDTA, pH 8.2, 95% formamide), incubate at 65C for 2 min. 2. Collect the magnetic beads by the magnetic separator andtransfer the supernatant to a fresh tube 但你的系統又略有所不同 可能要在修飾一下.. : 為什麼用2D? 因為2D一來我自己會，第二可以分的比較開 : (本來還想2D可以loading比較多的體積 蛋白質多，差異應該也多) : beads我剛說了，有跑而且有蛋白質~~~ : 再不行我看我先從1D著手好了 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 219.68.73.212