※ 引述《aggaci (有气质的台客)》之铭言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之铭言： : : ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ : : 可否请问 什麽作法?.. : 就是DNA affinity precipitation assay(简称DAPA) : DAPA做完後先跑一维SDS-PAGE看看差异 : (loading时，连beads也给她load下去了) : : 看不大懂.. : : 可否请问到底是 IP 没东西还是 IP 完跑 2D 後东西不见了? : 有东西，跑一维sds-page以银染染色是可以看到蛋白质的 : : 目的是否是要钓 transcription factor ? : 是 : : 如果是要钓 transcription factor : : 为何会预期 PAGE 上看的到明显的 band? : 为什麽不会?当然会看到蛋白质不是吗? o.O 有点不懂这里的意思哩~ : 应该是说wild type probe跟mutant probe比 : 有差异的点就是我要的蛋白质 感谢.. 由於之前说跑普通 PAGE 对我来说跳太快了 有点看不大懂 transcription factor 量随着蛋白质的不同而有差 不过一般来说都算是少量的蛋白质 所以我不确定到底是本身量就太少 还是後续的问题 so bead 抓蛋白质这方面没有问题 与蛋白质量上没有问题 : : bead 上到底蛋白质多不多? (是没 elute 下来还是根本极少蛋白质bind 在 bead上?) : : (何不取一点 bead 直接跑 PAGE ?) : : 且 IP 完跑 2D 的目的为何 ? : 很多，我已经跑8% acrylamide 13 cm的PAGE了 : 虽说有差异但还是分不太开 so 问题是rehydration buffer 无法将 target protein 自 bead 中 elute 下来了 try this protocol (查到的 ..只能尝试看看) ref : http://www.bioclon.com/magnetic-streptavidin-beads.pdf 节录自以上网站的 Protein or antibody To elute the bound biotinylated protein or antibody from BcMag.Streptavidin Magnetic Beads, add the appropriate amount of Elution Buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.5), incubate for 0.5-5 min at room temperature, collect the magnetic beads by the magnetic separator and transfer the supernatant to a fresh tube.Immediately neutralize the supernatant to pH 7.0 by adding 1/10 volume of Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0) DNA Long nucleic acids used as biotinylated probes are not recommended due to difficulty in elution. For short biotinylated oligos, user can try the following method: 1. To elute the bound biotinylated oligo from BcMag.Streptavidin Magnetic Beads, add appropriate amount of ElutionBuffer (10 mM EDTA, pH 8.2, 95% formamide), incubate at 65C for 2 min. 2. Collect the magnetic beads by the magnetic separator andtransfer the supernatant to a fresh tube 但你的系统又略有所不同 可能要在修饰一下.. : 为什麽用2D? 因为2D一来我自己会，第二可以分的比较开 : (本来还想2D可以loading比较多的体积 蛋白质多，差异应该也多) : beads我刚说了，有跑而且有蛋白质~~~ : 再不行我看我先从1D着手好了 --

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