※ 引述《[email protected] (六百)》之銘言： : ※ 引述《[email protected] (where to go)》之銘言： : > 刮細胞時是應該加入RIPA(含protease inhibitor)再刮,還是先用PBS刮下來 : > 收集至離心管後,移去上清液,再加入RIPA(含protease inhibitor)? : > 若先加入PBS來刮細胞,會不會因為尚未加入protease inhibitor於PBS, : > 使得在刮細胞過程中,因為細胞破裂,導致protease釋出而分解破壞protein? : 我想不出要先加PBS刮下來再換成RIPA的 : 而且可溶性的蛋白質在 PBS 下面也是會溶（一些）的 : 再製換成 RIPA, 原本溶在 PBS 中的不就損失了 : 會用到 PBS 的 應該是： : 先把細胞用 trypsin 或 EDTA 打下來以後 : 離心 去上清液 : 加PBS wash : 再離心 去上清液 : 加 RIPA : 這樣的流程 一般跑western 最怕的就是 phospho-protein 的磷酸根被分解吧 只要用上述大家提的方法收lysate 之後凍到 -80 其餘的protein 都還挺強壯的 不太會degrade 若要跑phospho-protein 我們使用的是 4X sample loading dye 直接在 dish 刮細胞 首先去除 medium 接下用 ice-cold PBS wash 之後加 loading dye 刮除 , sonication , 加熱 直接就可以跑了 這種方法不能夠以 BCA or Bio-Rad 定量 所以就用數細胞的方法 每個dish 都種一樣多 再用同體積的 dye 去 lysis loading也一樣 跑出來也就差不多囉 不然也可以染 actin 看怎樣來做調整 實驗室之前用RIPA 跑 phospho-protein 時有時無 很難搞 分不清是真的沒有還是收的過程就不見 用這方法就都沒問題了 供大家參考~ --

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