※ 引述《[email protected] (六百)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (where to go)》之铭言： : > 刮细胞时是应该加入RIPA(含protease inhibitor)再刮,还是先用PBS刮下来 : > 收集至离心管後,移去上清液,再加入RIPA(含protease inhibitor)? : > 若先加入PBS来刮细胞,会不会因为尚未加入protease inhibitor於PBS, : > 使得在刮细胞过程中,因为细胞破裂,导致protease释出而分解破坏protein? : 我想不出要先加PBS刮下来再换成RIPA的 : 而且可溶性的蛋白质在 PBS 下面也是会溶（一些）的 : 再制换成 RIPA, 原本溶在 PBS 中的不就损失了 : 会用到 PBS 的 应该是： : 先把细胞用 trypsin 或 EDTA 打下来以後 : 离心 去上清液 : 加PBS wash : 再离心 去上清液 : 加 RIPA : 这样的流程 一般跑western 最怕的就是 phospho-protein 的磷酸根被分解吧 只要用上述大家提的方法收lysate 之後冻到 -80 其余的protein 都还挺强壮的 不太会degrade 若要跑phospho-protein 我们使用的是 4X sample loading dye 直接在 dish 刮细胞 首先去除 medium 接下用 ice-cold PBS wash 之後加 loading dye 刮除 , sonication , 加热 直接就可以跑了 这种方法不能够以 BCA or Bio-Rad 定量 所以就用数细胞的方法 每个dish 都种一样多 再用同体积的 dye 去 lysis loading也一样 跑出来也就差不多罗 不然也可以染 actin 看怎样来做调整 实验室之前用RIPA 跑 phospho-protein 时有时无 很难搞 分不清是真的没有还是收的过程就不见 用这方法就都没问题了 供大家参考~ --

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