: 所使用的 primer 經過軟體測試 : Tm值大概是 57~60 : 我有跑 55 跟 60 度的 (annealing temp) : 結果長片段的(1kbp以上)出不來或是雜band(而且還沒期望出現的band) : 短片段的有些有出來有些出不來(或有雜band) 我覺得你可以試試把annealing溫度調得再低一點， 因為通常最適溫度會比預測溫度低五到十度 如果你的primer有secondary structure或GC含量高， 可以像前面有人建議的，用58度加dmso : 看文章說大片段的可以考慮用 pfu : 我就去弄來用用看 : 所使用的 program 是 : 95度 5min : 95度 1min ___ : 55度 2min |45cycles : 72度 2min ___| : 72度 7min : 結果原本做出單一短片段的反應做出了雜 pfu和一般的taq最大的差別是他有3'->5'profreading的功能， 而且他比較thermalstable， 文章建議大片段用pfu應該是因為片段越大越容易出錯， 用pfu可以增加擴增片段的正確率。 一般taq的效率約每30秒一kb， taq因為有profreading，比較慢，約一分鐘1kb， 如果用pfu要做3kb的片段，最好把extension時間設在三分鐘以上 --

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