: 所使用的 primer 经过软体测试 : Tm值大概是 57~60 : 我有跑 55 跟 60 度的 (annealing temp) : 结果长片段的(1kbp以上)出不来或是杂band(而且还没期望出现的band) : 短片段的有些有出来有些出不来(或有杂band) 我觉得你可以试试把annealing温度调得再低一点， 因为通常最适温度会比预测温度低五到十度 如果你的primer有secondary structure或GC含量高， 可以像前面有人建议的，用58度加dmso : 看文章说大片段的可以考虑用 pfu : 我就去弄来用用看 : 所使用的 program 是 : 95度 5min : 95度 1min ___ : 55度 2min |45cycles : 72度 2min ___| : 72度 7min : 结果原本做出单一短片段的反应做出了杂 pfu和一般的taq最大的差别是他有3'->5'profreading的功能， 而且他比较thermalstable， 文章建议大片段用pfu应该是因为片段越大越容易出错， 用pfu可以增加扩增片段的正确率。 一般taq的效率约每30秒一kb， taq因为有profreading，比较慢，约一分钟1kb， 如果用pfu要做3kb的片段，最好把extension时间设在三分钟以上 --

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