作者ctlee (寧靜小城)
看板Biotech
標題[問題] Ligation失敗(已看過)
時間Thu May 11 11:33:54 2006
請問各位高手
小弟現在要將3kb的PCR product接到一6.4kb的vector的Bgl II上
我先PCR amplify我的fragment
純化後用Bgl II切再gel purify以去除nonspecific products
至於vector, 我用Bgl II 切完純化後用CIAP做dephosphorylation
Ligation的時候insert:vector大約維持在5:1的比例
14 C overnight之後 transform到DH5alpha competent cells
奇怪的是,我的control(無insert)沒有任何colony
有insert的ligation 做transformation出來所得的clone全是self-ligation
我實在無法解釋這個結果,難道insert會促進self-ligation嗎
clone這個fragment好幾個月了都沒什麼進展,拜託各位幫忙了
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 128.138.41.88
1F：推 lnyhn:PCR產物直接切通常接不上一般都用TA cloning再轉到別的質體씠 05/11 11:53
2F：→ lnyhn:最近也有sticky-end PCR方法..使產務有接點..直接接的方法.. 05/11 11:55
3F：推 allmerit:推樓上 還是先接TA再切吧 05/11 12:27