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標 題Re: [問題] cloning和PCR
發信站批踢踢參 (Sat May 13 07:44:58 2006)
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※ 引述《[email protected] (NN )》之銘言：
: 照大大這樣講...
: 那cloning的主要目的是只有放大pcr product和出錯率降低..
: 那請問為何做第二次時,出錯率會大增?
舉個例子
我用市面上可以proof-read的polymerase
NEB的Phusion好了
error rate 1/4.4x10^7
1th PCR (template=cDNA)
你PCR的序列2kb, 20個cycle
2000x2^19=1x10^9
你的polymerase要新增1x10^9 nucleotides >> 4.4x10^7
如果要算error的話 可能會有23.6個隨機錯誤會產生
我這種算法 並沒有累計cycle數
假設變異發生在前幾個PCR cycle
你的PCR產物所有的隨機錯誤可能會更多
所以一般人做要cloning的PCR 都會盡量減低PCR cycle數
少加點Mg2+
寧願少一點產物 也不要有錯的產物
照你說的 把第一次PCR產物拿來再amplify一次
不就是把那些隨機錯誤繼續以2倍放大..
並且再累計更多polymerase新加的錯誤
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◆ From: 70.120.180.194