作者nothingelse (上邪)
看板Biotech
標題[問題] real time PCR
時間Wed May 24 02:33:21 2006
在設計primer的時候
原本是follow paper的設計
有先以傳統PCR test condition
看起來是major band
結果Q-PCR跑出來 (使用Roche lightcycler)
melting analysis可以看到三個peak (一般應該是要單一peak)
而且溫度都是80幾度以上 應該不是普通的primer dimer
更神奇的是連H20 negative control都有這樣的pattern且螢光也隨時間增加
看起來似乎是primer不夠specific
且primer或是H2O可能有contamination
不過我重新解凍primer結果還是一樣
相對的HPRT的結果下H20就沒有signal 螢光都很低
且sample也是只有single peak
懷疑可能是primer specificity真的太低了 (三個peak....orz)
或是primer之間形成了dimer或是更多的...(tetramer??)
後來上Roche公司提供的primer網站重新設計
結果他顯示沒有perfect或是good的primer
只有less than good的...不知道到底可不可以用
重新設計或是用其他的軟體predict
結果找到的似乎也難以避免會有primer dimer的形成 >"<
不知道板上有沒有遇過這種難纏的gene
最後是怎麼解決的 @@
ps.primer dimer的prediction如果有四個mer會互相作用 算是嚴重的嗎??
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◆ From: 61.228.137.242
1F：推 aggaci:連水都有，很明顯是primer dimer 05/24 18:52
2F：推 uys:試試看降低鎂離子的濃度吧...還有不要用傳統的PCRprimer 05/24 21:01
3F：→ uys:因為一般來說傳統的bp都太大了...建議是在100上下就好~ 05/24 21:02
4F：→ uys:roche的程式predic出來四個還好...當然沒有是最好啦~ 05/24 21:04
5F：推 vixen:只用一個primer作水的control有沒有雜band呢? 05/25 07:01
6F：推 nothingelse:後來發現跑gel 100bp就有signal 可能是primer xxmer 05/26 01:32
7F：→ nothingelse:這個primer應該是不能用了 感謝大家... 05/26 01:32