作者nothingelse (上邪)
看板Biotech
标题[问题] real time PCR
时间Wed May 24 02:33:21 2006
在设计primer的时候
原本是follow paper的设计
有先以传统PCR test condition
看起来是major band
结果Q-PCR跑出来 (使用Roche lightcycler)
melting analysis可以看到三个peak (一般应该是要单一peak)
而且温度都是80几度以上 应该不是普通的primer dimer
更神奇的是连H20 negative control都有这样的pattern且萤光也随时间增加
看起来似乎是primer不够specific
且primer或是H2O可能有contamination
不过我重新解冻primer结果还是一样
相对的HPRT的结果下H20就没有signal 萤光都很低
且sample也是只有single peak
怀疑可能是primer specificity真的太低了 (三个peak....orz)
或是primer之间形成了dimer或是更多的...(tetramer??)
後来上Roche公司提供的primer网站重新设计
结果他显示没有perfect或是good的primer
只有less than good的...不知道到底可不可以用
重新设计或是用其他的软体predict
结果找到的似乎也难以避免会有primer dimer的形成 >"<
不知道板上有没有遇过这种难缠的gene
最後是怎麽解决的 @@
ps.primer dimer的prediction如果有四个mer会互相作用 算是严重的吗??
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◆ From: 61.228.137.242
1F：推 aggaci:连水都有，很明显是primer dimer 05/24 18:52
2F：推 uys:试试看降低镁离子的浓度吧...还有不要用传统的PCRprimer 05/24 21:01
3F：→ uys:因为一般来说传统的bp都太大了...建议是在100上下就好~ 05/24 21:02
4F：→ uys:roche的程式predic出来四个还好...当然没有是最好啦~ 05/24 21:04
5F：推 vixen:只用一个primer作水的control有没有杂band呢? 05/25 07:01
6F：推 nothingelse:後来发现跑gel 100bp就有signal 可能是primer xxmer 05/26 01:32
7F：→ nothingelse:这个primer应该是不能用了 感谢大家... 05/26 01:32