※ 引述《CD3 (tot)》之銘言： : 我是使用DMSO作為抗凍劑 : 希望有人能提供詳盡的步驟 : 謝謝 DMSO最好使用 for gas chromatography的 (MERK,100ml瓶裝，小貴) 如果你只有 for spectroscopy的 (MERK,500ml瓶裝，便宜好幾倍)，那也行 不過建議以上兩種要分裝時都要用0.2μm的filter先濾過，把裡面的雜質渣 渣和細菌都濾掉 (尤其是如果你的DMSO是和別人共用的，就一定要先濾!) 這裡我以SP2小鼠骨髓癌瘤細胞為例， 細胞凍存： 1.先鏡檢細胞健康狀況，通常在視野下長到八成滿，細胞粒粒圓潤飽滿，處於 對數生長期，即是最加凍存時機。 2.配DMSO凍存液 (要現配，不能前一天配好放著備用)： DMEM:DMSO:FBS=3:1:4 即50%FBS DMSO凍存液，有的書上用20%FBS (即DMEM:DMSO:FBS=7:1:2)，我沒 試過，你可以試試看，可以的話告訴我一聲XD~ 3.倒掉舊medium，加入DMEM，使用γ滅菌過之滴管將細胞沖下來 (這只是SP2 細胞的處理方式，其他細胞有不同的處理方式)，倒入50ml離心管中離心 ( 850 rpm，5分鐘)。 4.倒掉上清液，用指腹將沉澱下來的細胞打散，冰浴下加入之前配的DMSO凍存液 如果細胞是養在T80 Flask中，這時細胞數目約為1×10^7個/ml，則要加3ml的 DMSO凍存液，分裝成三個冷凍小管(每管1ml)，將細胞密度控制在1×10^6個/ml。 5.將細胞懸液分裝入冷凍小管後，旋緊管蓋。在小管上標明細胞名稱、培養液名稱 和凍存日期及操作人。 6.放進15ml離心管的25孔保麗龍底座中，在-20℃下放置30分鐘 (有的書上寫4℃/ 30分鐘，你也可以試試看XD~)。 7.用3~4張報紙 (經驗談：水果日報最好用，紙質超厚使用多次不會爛，加上時常 有美女圖賞心悅目…) 將25孔保麗龍座包好，丟進-80℃冰箱中over night (注 意!!一定不能倒放，不然以後解凍時你就準備爆吧…)。 8.隔天將冷凍小管移入液態氮中，如果你很忙的話，冷凍細胞可以在-80℃冰箱中 放3~4個禮拜，不過還是儘早移啦!畢竟有時會有天災 (停電) 人禍 (白目學弟妹 冰箱沒關好或放假前把"所有"的電器用品關機…)，早移早安心咩~ 9.冷凍小管移入液態氮桶時一定要快，不能讓冷凍小管回溫，一旦回溫到-30℃以上 時就會開始長冰晶，如果動作比較慢的人，建議可以取些液態氮到冰桶中，將 冷凍小管先浸在液態氮中，這時就可以慢慢記錄冷凍小管在液態氮桶中的位置， 然後歸位。 先醬子，細胞冷凍和解凍講究的是『慢凍快融』，冷凍細胞比較沒有什麼小撇步 解凍細胞就有很多小撇步來增加細胞存活率，等下次再寫唄~~~ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.79.172