※ 引述《CD3 (tot)》之铭言： : 我是使用DMSO作为抗冻剂 : 希望有人能提供详尽的步骤 : 谢谢 DMSO最好使用 for gas chromatography的 (MERK,100ml瓶装，小贵) 如果你只有 for spectroscopy的 (MERK,500ml瓶装，便宜好几倍)，那也行 不过建议以上两种要分装时都要用0.2μm的filter先滤过，把里面的杂质渣 渣和细菌都滤掉 (尤其是如果你的DMSO是和别人共用的，就一定要先滤!) 这里我以SP2小鼠骨髓癌瘤细胞为例， 细胞冻存： 1.先镜检细胞健康状况，通常在视野下长到八成满，细胞粒粒圆润饱满，处於 对数生长期，即是最加冻存时机。 2.配DMSO冻存液 (要现配，不能前一天配好放着备用)： DMEM:DMSO:FBS=3:1:4 即50%FBS DMSO冻存液，有的书上用20%FBS (即DMEM:DMSO:FBS=7:1:2)，我没 试过，你可以试试看，可以的话告诉我一声XD~ 3.倒掉旧medium，加入DMEM，使用γ灭菌过之滴管将细胞冲下来 (这只是SP2 细胞的处理方式，其他细胞有不同的处理方式)，倒入50ml离心管中离心 ( 850 rpm，5分钟)。 4.倒掉上清液，用指腹将沉淀下来的细胞打散，冰浴下加入之前配的DMSO冻存液 如果细胞是养在T80 Flask中，这时细胞数目约为1×10^7个/ml，则要加3ml的 DMSO冻存液，分装成三个冷冻小管(每管1ml)，将细胞密度控制在1×10^6个/ml。 5.将细胞悬液分装入冷冻小管後，旋紧管盖。在小管上标明细胞名称、培养液名称 和冻存日期及操作人。 6.放进15ml离心管的25孔保丽龙底座中，在-20℃下放置30分钟 (有的书上写4℃/ 30分钟，你也可以试试看XD~)。 7.用3~4张报纸 (经验谈：水果日报最好用，纸质超厚使用多次不会烂，加上时常 有美女图赏心悦目…) 将25孔保丽龙座包好，丢进-80℃冰箱中over night (注 意!!一定不能倒放，不然以後解冻时你就准备爆吧…)。 8.隔天将冷冻小管移入液态氮中，如果你很忙的话，冷冻细胞可以在-80℃冰箱中 放3~4个礼拜，不过还是尽早移啦!毕竟有时会有天灾 (停电) 人祸 (白目学弟妹 冰箱没关好或放假前把"所有"的电器用品关机…)，早移早安心咩~ 9.冷冻小管移入液态氮桶时一定要快，不能让冷冻小管回温，一旦回温到-30℃以上 时就会开始长冰晶，如果动作比较慢的人，建议可以取些液态氮到冰桶中，将 冷冻小管先浸在液态氮中，这时就可以慢慢记录冷冻小管在液态氮桶中的位置， 然後归位。 先酱子，细胞冷冻和解冻讲究的是『慢冻快融』，冷冻细胞比较没有什麽小撇步 解冻细胞就有很多小撇步来增加细胞存活率，等下次再写呗~~~ --

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