※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言： : : 雖說你說不要用電極.. 但還是提供一個用電極且省錢的 : : 我們實驗室有 electroelutor.各家的都很難用 又貴(當初我試過三大廠牌 都不及格).. : : 另一個方法是將膠切下來 包在透析膜裡 丟到水平電泳槽 把蛋白質電出來 : : 那你怎知蛋白質被電出來了沒?.. : : 簡單.. 準備一個透析膜 裡面包經過 CBG-R or G 染色的 band : : (隨便找個load個蛋白質跑 SDS PAGE 跑完染膠後切下來) : : 這個 control 組與你的 target protein 兩包透析膜一起丟到水平電泳槽一起電 : : 這當成 control 如果蛋白質被電出來了 這個control 組的顏色就會變淡 : : (藍色被電出來) : : 你的蛋白質就可以收了.. 透析膜剛拿出來不需打開 直接透析濃縮 蛋白質就出來了 : : 電極方向也不需太擔心 即便因為是 native PAGE 蛋白質帶電荷不同 跑反了 : : 你的蛋白質仍是被限制在透析膜跑不出來 : : 活性都好好的.. : : 這方法比買又貴又難用的 electoelutor.. : : 或是用超音波震 回收率都沒太糟.. : : 這方法注意兩個重點.. : : buffer 要適當 : : 再來是透析膜綁好.沒綁好被電出去我也沒辦法 : 透析膜阿? : 可是切下來的gel不就小小一塊 : 用到透析膜感覺像是buffer相對於gel要加不少吧?(1 cc要嗎?) : 那降子不就被大量稀釋了 先解決 R大的問題.. .. 呵呵 注意我的文章. 我的文章只說 control 組要染 因為這是對照組 我可沒說原po 的 target protein要染喔 因為對造組不染的話 你無從觀察到底電出來沒阿..(從dye 的 difussion) 至於不染怎知你的 target protein 在那?.. 當然最簡單是對造 western 的 preblue marker 阿 不然用 UV 觀查都行 當然有其他撇步能看到protein又不傷蛋白質的方法... 原po前述方法不行在說.. 在來是 原po的問題 當然 如果你protein多的話 當然是用厚膠不加well 整個砸下去 protein 少的話, 1cc buffer 算什麼問題 用centricon 濃縮就好啦.. 怕蛋白質少的可憐的話 離一離不見了 不介意 denature 的話 把電好的透析一下 拿去冷凍乾燥..(你不透析 乾燥完出來的都是鹽) 1cc冷凍乾燥應該不須一小時吧... 至於去除DNA呢?... 你 plasmid 怎麼抽的就是怎麼解決阿... DNA 完全帶負電 (相較於蛋白質的話) 要我就 denature 蛋白質後用 類似像 DEAE 的 gel 應該夠把蛋白質分開了 當然 我個人很懶.. 連 packing column都很懶.. 如果我是你就把 蛋白質煮一煮 直接loading 進 PCR clean up 的 column 離心下來後的東西應該是你的蛋白質 而 DNA bind在 column的 gel 上 在用kit的 buffer wash 一下 說不定你的 probe 還可以回收使用哩... 成本... 20 塊錢.... 試試何防?.. --

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