※ 引述《aggaci (有气质的台客)》之铭言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之铭言： : : 虽说你说不要用电极.. 但还是提供一个用电极且省钱的 : : 我们实验室有 electroelutor.各家的都很难用 又贵(当初我试过三大厂牌 都不及格).. : : 另一个方法是将胶切下来 包在透析膜里 丢到水平电泳槽 把蛋白质电出来 : : 那你怎知蛋白质被电出来了没?.. : : 简单.. 准备一个透析膜 里面包经过 CBG-R or G 染色的 band : : (随便找个load个蛋白质跑 SDS PAGE 跑完染胶後切下来) : : 这个 control 组与你的 target protein 两包透析膜一起丢到水平电泳槽一起电 : : 这当成 control 如果蛋白质被电出来了 这个control 组的颜色就会变淡 : : (蓝色被电出来) : : 你的蛋白质就可以收了.. 透析膜刚拿出来不需打开 直接透析浓缩 蛋白质就出来了 : : 电极方向也不需太担心 即便因为是 native PAGE 蛋白质带电荷不同 跑反了 : : 你的蛋白质仍是被限制在透析膜跑不出来 : : 活性都好好的.. : : 这方法比买又贵又难用的 electoelutor.. : : 或是用超音波震 回收率都没太糟.. : : 这方法注意两个重点.. : : buffer 要适当 : : 再来是透析膜绑好.没绑好被电出去我也没办法 : 透析膜阿? : 可是切下来的gel不就小小一块 : 用到透析膜感觉像是buffer相对於gel要加不少吧?(1 cc要吗?) : 那降子不就被大量稀释了 先解决 R大的问题.. .. 呵呵 注意我的文章. 我的文章只说 control 组要染 因为这是对照组 我可没说原po 的 target protein要染喔 因为对造组不染的话 你无从观察到底电出来没阿..(从dye 的 difussion) 至於不染怎知你的 target protein 在那?.. 当然最简单是对造 western 的 preblue marker 阿 不然用 UV 观查都行 当然有其他撇步能看到protein又不伤蛋白质的方法... 原po前述方法不行在说.. 在来是 原po的问题 当然 如果你protein多的话 当然是用厚胶不加well 整个砸下去 protein 少的话, 1cc buffer 算什麽问题 用centricon 浓缩就好啦.. 怕蛋白质少的可怜的话 离一离不见了 不介意 denature 的话 把电好的透析一下 拿去冷冻乾燥..(你不透析 乾燥完出来的都是盐) 1cc冷冻乾燥应该不须一小时吧... 至於去除DNA呢?... 你 plasmid 怎麽抽的就是怎麽解决阿... DNA 完全带负电 (相较於蛋白质的话) 要我就 denature 蛋白质後用 类似像 DEAE 的 gel 应该够把蛋白质分开了 当然 我个人很懒.. 连 packing column都很懒.. 如果我是你就把 蛋白质煮一煮 直接loading 进 PCR clean up 的 column 离心下来後的东西应该是你的蛋白质 而 DNA bind在 column的 gel 上 在用kit的 buffer wash 一下 说不定你的 probe 还可以回收使用哩... 成本... 20 块钱.... 试试何防?.. --

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