※ 引述《threestars (等待)》之銘言： : ※ 引述《[email protected] (realm)》之銘言： : : 這是我第一次做蛋白質表現... : : 我的是帶有his-tag的蛋白質...於E. coli中表現... : : 用Ni-NTA進行純化... : : 目前的問題是...我懷疑是因為表現量太高...所以我的蛋白在pellet的部分... : : 就我所知, 透過調整培養條件等等...可以將pellet的蛋白變成在supernatant中... : : 我之前的條件...37度, 0.5 mM IPTG, 6小時 : : 我在想...將溫度改成30度...減少IPTG的量...不過不知道該減少到多少... : : induction的時間是否需要調整... : : 因此想請教有相關經驗的大大~~能否提供一些經驗分享~~ : : ...另外想問我的觀念是否正確... : : 之所以可以將pellet中的蛋白變到supernatant中... : : 主要是因為透過培養條件的調整, 使蛋白的表現量下降... : : 這樣的觀念對嗎?? : : 先謝過~~:) : 說表現量太高也不完全錯 : 可以說是 短時間內 蛋白質表現量過大 : 形成inclusion Body : 降低溫度 也是一個手段 可以用30 25 20度去試試看 : 但是形成inclusion Body 不一定只是溫度太高的問題 : 第一個比較糟糕的可能是 你的蛋白質序列可能有突變 : 而無法的形成正常結構 導致是以peptide形式出來 如果量又多 : 容易形成Inclusion Body : 如果你用低溫（20度）induction 還是一樣的話 就要小心了 : 第二個 比較樂觀的可能是 你用的菌株 如果是BL21 : 因為他細胞質環境處於還原狀態（E.coli都是） 所以雙硫鍵無法形成 : 容易使出來的protein處在peptide形式 : 可以用origami (<-不知有沒有拼對) 這個E.coli不會破壞雙硫鍵 最近也是在做origami的表現，只是還剛剛開始，所以還不知道結果。 只是我是一次使用origami，同時我也有使用rosetta，都是用commercial competent cell，一樣的DNA量來transformation，rosetta很正常的只長出約10個colonies，但 是origami卻是一堆滿滿小小，長滿全部plate，不注意看還以為沒長哩！所以如果用 origami的人，要注意喔，千萬不要貪多。 另外只是比較好奇的就是，有沒有集origami和rosetta優點於一身的菌阿。 通常disulfide bond也是在mammalian protein上較多於一般真核的protein。 只是異想天開想問問有沒有集兩種優點於一身的表現host! ^^Y : 但表現量感覺比BL21差（這只是感覺我沒做比較） : 基本上induction的條件要慢慢去抓 : 當然如果之前有人純化過這種蛋白 有條件的話 : 會比較輕鬆 : 祝好運～～ --

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