※ 引述《threestars (等待)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (realm)》之铭言： : : 这是我第一次做蛋白质表现... : : 我的是带有his-tag的蛋白质...於E. coli中表现... : : 用Ni-NTA进行纯化... : : 目前的问题是...我怀疑是因为表现量太高...所以我的蛋白在pellet的部分... : : 就我所知, 透过调整培养条件等等...可以将pellet的蛋白变成在supernatant中... : : 我之前的条件...37度, 0.5 mM IPTG, 6小时 : : 我在想...将温度改成30度...减少IPTG的量...不过不知道该减少到多少... : : induction的时间是否需要调整... : : 因此想请教有相关经验的大大~~能否提供一些经验分享~~ : : ...另外想问我的观念是否正确... : : 之所以可以将pellet中的蛋白变到supernatant中... : : 主要是因为透过培养条件的调整, 使蛋白的表现量下降... : : 这样的观念对吗?? : : 先谢过~~:) : 说表现量太高也不完全错 : 可以说是 短时间内 蛋白质表现量过大 : 形成inclusion Body : 降低温度 也是一个手段 可以用30 25 20度去试试看 : 但是形成inclusion Body 不一定只是温度太高的问题 : 第一个比较糟糕的可能是 你的蛋白质序列可能有突变 : 而无法的形成正常结构 导致是以peptide形式出来 如果量又多 : 容易形成Inclusion Body : 如果你用低温（20度）induction 还是一样的话 就要小心了 : 第二个 比较乐观的可能是 你用的菌株 如果是BL21 : 因为他细胞质环境处於还原状态（E.coli都是） 所以双硫键无法形成 : 容易使出来的protein处在peptide形式 : 可以用origami (<-不知有没有拼对) 这个E.coli不会破坏双硫键 最近也是在做origami的表现，只是还刚刚开始，所以还不知道结果。 只是我是一次使用origami，同时我也有使用rosetta，都是用commercial competent cell，一样的DNA量来transformation，rosetta很正常的只长出约10个colonies，但 是origami却是一堆满满小小，长满全部plate，不注意看还以为没长哩！所以如果用 origami的人，要注意喔，千万不要贪多。 另外只是比较好奇的就是，有没有集origami和rosetta优点於一身的菌阿。 通常disulfide bond也是在mammalian protein上较多於一般真核的protein。 只是异想天开想问问有没有集两种优点於一身的表现host! ^^Y : 但表现量感觉比BL21差（这只是感觉我没做比较） : 基本上induction的条件要慢慢去抓 : 当然如果之前有人纯化过这种蛋白 有条件的话 : 会比较轻松 : 祝好运～～ --

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