※ 引述《[email protected] (可愛女孩)》之銘言： : ※ 引述《[email protected] (有氣質的台客)》之銘言： : : 我用PIERCE的KIT可以分的很乾淨，但是他的KIT很貴 : : 所以若不是非常要求，我用土法即可以收到純度還不錯的核蛋白 : : 若你要土法的步驟，再跟我講 : 可以跟大大要一下protocal嗎 : 我也再做這部份實驗 但是一直分不乾淨 謝謝 : 信箱是 [email protected] 抽核蛋白 1.細胞以cold PBS wash 2.離心 4000rpm/5min at 4℃ 3.以extraction buffer將細胞打散 *extraction buffer [10 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、20% glycerol、 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin] 4. 置冰上15分鐘 5. 以針筒+針頭『吸放』cell藉以打破細胞 6. 離心14000 rpm/1min 7. 去除上清液(上清液為cytosolic protein) 8. 沉澱物以nuclear extraction buffer打散 ﹡nuclear extraction buffer [500 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、10% glycerol、 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin] 9. vortex 最高轉速15sec/10min 3~6次，期間至於冰上 10. 14000 rpm/5 min at 4℃，上清液為nuclear extract 11.測蛋白質濃度，分裝存放於-80冰箱 這個方法會有些抽到cytosolic protein 有以tubulin為negative control做過測試 但是跟cytosolic part的tubulin比起來差很多 -- http://0rz.net/da0PG 我的相簿.... 興趣:做實驗、看PAPER、玩音響、聽音樂、養楓葉鼠、彈鋼琴 --

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