※ 引述《[email protected] (可爱女孩)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (有气质的台客)》之铭言： : : 我用PIERCE的KIT可以分的很乾净，但是他的KIT很贵 : : 所以若不是非常要求，我用土法即可以收到纯度还不错的核蛋白 : : 若你要土法的步骤，再跟我讲 : 可以跟大大要一下protocal吗 : 我也再做这部份实验 但是一直分不乾净 谢谢 : 信箱是 [email protected] 抽核蛋白 1.细胞以cold PBS wash 2.离心 4000rpm/5min at 4℃ 3.以extraction buffer将细胞打散 *extraction buffer [10 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、20% glycerol、 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin] 4. 置冰上15分钟 5. 以针筒+针头『吸放』cell藉以打破细胞 6. 离心14000 rpm/1min 7. 去除上清液(上清液为cytosolic protein) 8. 沉淀物以nuclear extraction buffer打散 ﹡nuclear extraction buffer [500 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、10% glycerol、 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin] 9. vortex 最高转速15sec/10min 3~6次，期间至於冰上 10. 14000 rpm/5 min at 4℃，上清液为nuclear extract 11.测蛋白质浓度，分装存放於-80冰箱 这个方法会有些抽到cytosolic protein 有以tubulin为negative control做过测试 但是跟cytosolic part的tubulin比起来差很多 -- http://0rz.net/da0PG 我的相簿.... 兴趣:做实验、看PAPER、玩音响、听音乐、养枫叶鼠、弹钢琴 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.100.165