作者wenniefrog (wenniefrog)
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標題Re: [問題] PCR 越來越神了,麻煩大家幫我解惑
時間Tue Jul 18 02:50:24 2006
你的主要問題是 剛做好的cDNA作第一次PCR的時候有訊號
可是拿同樣的cDNA再做幾次實驗結果就越來越弱?
如果是這樣的話 很可能真的是cDNA degrade了
cDNA沒有你想像中的強壯 冷凍解凍數次以後很容易降解
我以前會作完cDNA以後馬上分裝 存在-20度
每次就只拿一個batch出來解凍 希望這樣有幫助^^
※ 引述《[email protected] ( 做easy讓我很busy)》之銘言：
: > 我DNA都存在-40度喔
: > 不過如果你們實驗室沒有這樣的冷凍櫃就沒辦法了
: -40嗎 我問問看老師有沒有
: > 只能說 趕快用掉吧
: > 至於你的PCR..
: > 你沒說你不同條件是哪裡不同耶?
: 條件是因為另一組引子長度跟GC%不同 所以PCR才換條件
: 這2組引子做出來都沒有nonspecific band
: annealing temp 是49度左右
: > 通常越亮表示產物越多
: > 產物越多 表示鏈合反應條件比較不嚴苛
: > (通常是溫度比較低)
: > 或是cycle數比較多
: > 如果同樣條件 作不同重複 而有你所說的那個情形
: > 很有可能是DNA degrad了
: 用第一組引子PCR之後,第一次很亮,第二次1/10,第三次...就看不到了
: 這時我也以為cDNA degrade 但是用這一管cDNA (認為應該degrade光)
: 用另一對引子: 第一次有band 且很亮
: 但是用這一對再做第二次第三次...看不見了 = =
: > 不管怎樣 你最好先做個小實驗
: > 一部分一部分確定 看是哪個環節有問題
: > 就是所有條件都固定 只有一個變因 慢慢試
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◆ From: 130.219.235.253
1F：推 gwendiline:嗯 我也是分裝很多 一管大概只有500micro L(1O.D) 07/18 09:52
2F：→ gwendiline:打錯了" O".D 07/18 09:54
3F：推 ghjkl:你的cDNA也未免太多了吧 會不會是定量有問題 07/18 13:08
4F：推 nerdz:可能RT就有問題了..剛開始還在用RNA在P後來用光就P不出來? 12/14 02:36
5F：推 st92013:500uL???? 無敵多... 05/26 16:08