作者wenniefrog (wenniefrog)
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标题Re: [问题] PCR 越来越神了,麻烦大家帮我解惑
时间Tue Jul 18 02:50:24 2006
你的主要问题是 刚做好的cDNA作第一次PCR的时候有讯号
可是拿同样的cDNA再做几次实验结果就越来越弱?
如果是这样的话 很可能真的是cDNA degrade了
cDNA没有你想像中的强壮 冷冻解冻数次以後很容易降解
我以前会作完cDNA以後马上分装 存在-20度
每次就只拿一个batch出来解冻 希望这样有帮助^^
※ 引述《[email protected] ( 做easy让我很busy)》之铭言：
: > 我DNA都存在-40度喔
: > 不过如果你们实验室没有这样的冷冻柜就没办法了
: -40吗 我问问看老师有没有
: > 只能说 赶快用掉吧
: > 至於你的PCR..
: > 你没说你不同条件是哪里不同耶?
: 条件是因为另一组引子长度跟GC%不同 所以PCR才换条件
: 这2组引子做出来都没有nonspecific band
: annealing temp 是49度左右
: > 通常越亮表示产物越多
: > 产物越多 表示链合反应条件比较不严苛
: > (通常是温度比较低)
: > 或是cycle数比较多
: > 如果同样条件 作不同重复 而有你所说的那个情形
: > 很有可能是DNA degrad了
: 用第一组引子PCR之後,第一次很亮,第二次1/10,第三次...就看不到了
: 这时我也以为cDNA degrade 但是用这一管cDNA (认为应该degrade光)
: 用另一对引子: 第一次有band 且很亮
: 但是用这一对再做第二次第三次...看不见了 = =
: > 不管怎样 你最好先做个小实验
: > 一部分一部分确定 看是哪个环节有问题
: > 就是所有条件都固定 只有一个变因 慢慢试
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◆ From: 130.219.235.253
1F：推 gwendiline:嗯 我也是分装很多 一管大概只有500micro L(1O.D) 07/18 09:52
2F：→ gwendiline:打错了" O".D 07/18 09:54
3F：推 ghjkl:你的cDNA也未免太多了吧 会不会是定量有问题 07/18 13:08
4F：推 nerdz:可能RT就有问题了..刚开始还在用RNA在P後来用光就P不出来? 12/14 02:36
5F：推 st92013:500uL???? 无敌多... 05/26 16:08