※ 引述《linker0726 (試著獨立)》之銘言： : ※ 引述《threestars (等待)》之銘言： : : 最近一直在押 ERK : : 你問的是protein的ERK1/2 還是phospho-ERK : : ERK量比較少本來是要壓久一點 但20分鐘好像太久了 : : 你的ECL有稀釋嗎？ : : ERK 1：1000算滿濃的 如果還出不來 你可能要檢查一下是不是1抗或2抗壞掉 : : 抗體加入blocking buffer時 buffer溫度太高也不行 : : 如果是phospho-ERK 又比ERK弱 : : 我之前ERK和phospho-ERK 都用Santa Cruz : : ERK還OK phospho-ERK有夠糟糕 壓了兩個月 看的到band : : 但雜band一堆 要不就是背景直很髒 : : 就像之前版友講的 一樣狀況 聖誕牌很糟糕 : : 跟老闆講又不太相信 一直叫我試條件 : : 直到有其他老師跟他講說聖誕牌的會這樣他才相信 : : （好像是跟抗體不同批號有時候會出現特好或特壞的狀況） : : 最近換cell signaling 一下就出來拉 漂漂亮亮 : 嗯嗯...其實我是新手..這是第二次自己跑western blot.. : 請問一些很基本的問題..我怕我是不是記錯了... : ERK還是phospho-ERK的訊號哪個比較強阿...我有點搞混了...只記得壓第一片時螢光很 : 明顯.壓了一秒BAND就很漂亮了..我記得這個是ERK吧..(也就是說我第一篇文打錯了..) : 應該是phospho-ERK壓不出來 (這個比較難出來???) : 另外.昨天有跟老師討論，他說有可能是我加2抗的時候，用MILK當稀釋關係... : 可是之前學長姐說加MILK會讓背景比較乾淨... : 於是我昨天跑今天壓了一片..可是不用MILK稀釋2抗..改用PBS 1X稀釋... : 是有跑出點東西了..但雜BAND還滿多的...還跑出來不是預期的BAND Orz : 等會再問看看我們家是不是用聖誕牌的 = = : 好像是...不過在確定一次 : 因為之前有換過一次抗體..但壓出來...band爆多的= = 幾乎每個不同的kD都跑出來.. : 專一性有點問題..就退掉了..所以現在我也不知道是用什麼牌子的 : 先在問看看囉... : 還有..用PBS會不會干擾phospho-ERK阿? 都有磷酸.... : 你都用什麼稀釋阿?? PBS應該不會干擾 用PBST效果很OK 稀釋抗體我用blocking buffer 也就是10% 安佳脫脂奶粉(好像安佳的效果最好)溶在HBS buffer 我也用過 實驗用BSA/PBST(PBS+Tween20) 也是10% 效果更好 不過實驗用BSA 很貴 所以我比較少用 (TBST 我沒試過 不過隔壁實驗室的說 加了Tris-base後怪怪的 所以我就沒有用了) 之前有一段時間用5% 也是OK phospho-ERK 訊號弱很多 最好能有control 來確定是實驗出錯(操作或試劑問題)還是本身實驗就沒有磷酸化的結果 換了 cell signaling 我真的覺得抗體本身的品質是影響最大的 雖然Santa Cruz便宜很多但data出不來 結果浪費更多其他的regent 也浪費時間 如果聖誕牌的抗體 很糟糕 你可以去跟弘晉抱怨 要求可不可以換不同批號 的抗體 不過要填很多問題給Snanta Cruz原廠 還有附上做不出來的照片 或問題很多的data 大約兩三個禮拜 就會有新抗體過來了 -- 如果活在世上只是扮演著大家所期望的自己 那扮演好了又怎樣 不如靜靜的讓自己消失吧 總是多餘的存在只是種荒謬的錯誤 --

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