※ 引述《linker0726 (试着独立)》之铭言： : ※ 引述《threestars (等待)》之铭言： : : 最近一直在押 ERK : : 你问的是protein的ERK1/2 还是phospho-ERK : : ERK量比较少本来是要压久一点 但20分钟好像太久了 : : 你的ECL有稀释吗？ : : ERK 1：1000算满浓的 如果还出不来 你可能要检查一下是不是1抗或2抗坏掉 : : 抗体加入blocking buffer时 buffer温度太高也不行 : : 如果是phospho-ERK 又比ERK弱 : : 我之前ERK和phospho-ERK 都用Santa Cruz : : ERK还OK phospho-ERK有够糟糕 压了两个月 看的到band : : 但杂band一堆 要不就是背景直很脏 : : 就像之前版友讲的 一样状况 圣诞牌很糟糕 : : 跟老板讲又不太相信 一直叫我试条件 : : 直到有其他老师跟他讲说圣诞牌的会这样他才相信 : : （好像是跟抗体不同批号有时候会出现特好或特坏的状况） : : 最近换cell signaling 一下就出来拉 漂漂亮亮 : 嗯嗯...其实我是新手..这是第二次自己跑western blot.. : 请问一些很基本的问题..我怕我是不是记错了... : ERK还是phospho-ERK的讯号哪个比较强阿...我有点搞混了...只记得压第一片时萤光很 : 明显.压了一秒BAND就很漂亮了..我记得这个是ERK吧..(也就是说我第一篇文打错了..) : 应该是phospho-ERK压不出来 (这个比较难出来???) : 另外.昨天有跟老师讨论，他说有可能是我加2抗的时候，用MILK当稀释关系... : 可是之前学长姐说加MILK会让背景比较乾净... : 於是我昨天跑今天压了一片..可是不用MILK稀释2抗..改用PBS 1X稀释... : 是有跑出点东西了..但杂BAND还满多的...还跑出来不是预期的BAND Orz : 等会再问看看我们家是不是用圣诞牌的 = = : 好像是...不过在确定一次 : 因为之前有换过一次抗体..但压出来...band爆多的= = 几乎每个不同的kD都跑出来.. : 专一性有点问题..就退掉了..所以现在我也不知道是用什麽牌子的 : 先在问看看罗... : 还有..用PBS会不会干扰phospho-ERK阿? 都有磷酸.... : 你都用什麽稀释阿?? PBS应该不会干扰 用PBST效果很OK 稀释抗体我用blocking buffer 也就是10% 安佳脱脂奶粉(好像安佳的效果最好)溶在HBS buffer 我也用过 实验用BSA/PBST(PBS+Tween20) 也是10% 效果更好 不过实验用BSA 很贵 所以我比较少用 (TBST 我没试过 不过隔壁实验室的说 加了Tris-base後怪怪的 所以我就没有用了) 之前有一段时间用5% 也是OK phospho-ERK 讯号弱很多 最好能有control 来确定是实验出错(操作或试剂问题)还是本身实验就没有磷酸化的结果 换了 cell signaling 我真的觉得抗体本身的品质是影响最大的 虽然Santa Cruz便宜很多但data出不来 结果浪费更多其他的regent 也浪费时间 如果圣诞牌的抗体 很糟糕 你可以去跟弘晋抱怨 要求可不可以换不同批号 的抗体 不过要填很多问题给Snanta Cruz原厂 还有附上做不出来的照片 或问题很多的data 大约两三个礼拜 就会有新抗体过来了 -- 如果活在世上只是扮演着大家所期望的自己 那扮演好了又怎样 不如静静的让自己消失吧 总是多余的存在只是种荒谬的错误 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 218.164.160.73