※ 引述《mikoyan (mikoyan)》之銘言： : 各位學長姊, : 剛剛上課學習如何分析 Real Time-PCR 的圖, 產生了不少疑惑..... : 請各位學長姊協助我釐清一些觀念～ : 簡單介紹我們練習的材料: : Nanog gene, Forward & Reverse Primers, TaqMAN, SYBR I. : 以下是我的疑惑... : 1. 為什麼要到了 30 ~ 40 cycles 才會出現 ct 值 ? : 而不是一開始前幾個 cycle 就有 ct 值的出現 ? : 2. 30th cycle 前, threshold line 以下就已經有螢光訊號了, : 為什麼這些不是有效的 PCR 訊號 ? : 而要等到 30~40th cycle 以後才會出現具有代表性的訊號 ? : 我個人的想法是: : 這些不具代表性的訊號可能來自於 primer dimers 和 quencher-reporter dye probes : 之間作用所產生的訊號.... : 以上是我對第二個疑惑的想法, 第一個.... 我還在釐清中......... >"<~ 1. 30-40 cycle才過Ct 代表你的sample 是low copy number 簡單的說 target DNA濃度不高 所以primer 沒有很快的 進行PCR cycle 大量複製出DNA 想要快速達到Ct值可以試著增加DNA濃度 舉例來說 mtDNA為檢體時 螢光訊號很快就可以超越Ct... 因為mtDNA有母系遺傳 以及HIGH copy number的特性 2. 我知道的SYBR... 裡面沒有Quencher dye耶... 會用到Quencher-Repoter dye probe的是 Taqman SNP assay 我知道 Ct 界線下 會有螢光沒錯... 但是那只是因為前十幾次PCR產生短片段雙股DNA所出現的螢光訊號 要到十幾個Cycle後(前面先複製了一堆template) 每次PCR產物皆以 log 方式增加 螢光才會跟著上升 越過Ct..... 當你的DNA濃度低 所含的Target DNA也比較少 所以需要比較多的Cycle才可以讓複製呈現 log 方式上升 我在1.已經有說建議的方法 當然 不只那個方法啦...... 以上是我對Real-time的了解.... -- 我家是買ABI 7900HT 不知道您的設備是? --

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