※ 引述《mikoyan (mikoyan)》之铭言： : 各位学长姊, : 刚刚上课学习如何分析 Real Time-PCR 的图, 产生了不少疑惑..... : 请各位学长姊协助我厘清一些观念～ : 简单介绍我们练习的材料: : Nanog gene, Forward & Reverse Primers, TaqMAN, SYBR I. : 以下是我的疑惑... : 1. 为什麽要到了 30 ~ 40 cycles 才会出现 ct 值 ? : 而不是一开始前几个 cycle 就有 ct 值的出现 ? : 2. 30th cycle 前, threshold line 以下就已经有萤光讯号了, : 为什麽这些不是有效的 PCR 讯号 ? : 而要等到 30~40th cycle 以後才会出现具有代表性的讯号 ? : 我个人的想法是: : 这些不具代表性的讯号可能来自於 primer dimers 和 quencher-reporter dye probes : 之间作用所产生的讯号.... : 以上是我对第二个疑惑的想法, 第一个.... 我还在厘清中......... >"<~ 1. 30-40 cycle才过Ct 代表你的sample 是low copy number 简单的说 target DNA浓度不高 所以primer 没有很快的 进行PCR cycle 大量复制出DNA 想要快速达到Ct值可以试着增加DNA浓度 举例来说 mtDNA为检体时 萤光讯号很快就可以超越Ct... 因为mtDNA有母系遗传 以及HIGH copy number的特性 2. 我知道的SYBR... 里面没有Quencher dye耶... 会用到Quencher-Repoter dye probe的是 Taqman SNP assay 我知道 Ct 界线下 会有萤光没错... 但是那只是因为前十几次PCR产生短片段双股DNA所出现的萤光讯号 要到十几个Cycle後(前面先复制了一堆template) 每次PCR产物皆以 log 方式增加 萤光才会跟着上升 越过Ct..... 当你的DNA浓度低 所含的Target DNA也比较少 所以需要比较多的Cycle才可以让复制呈现 log 方式上升 我在1.已经有说建议的方法 当然 不只那个方法啦...... 以上是我对Real-time的了解.... -- 我家是买ABI 7900HT 不知道您的设备是? --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 210.201.40.216 ※ 编辑: huangsw 来自: 210.201.40.216 (07/30 18:04)