不好意思，請高手幫幫我 1.就是我的目標基因 （insert，約400bp），接上T-A Vector， 送入E .coil中transform放大之後， 無法從T-A Vector 上切下來， 就無法把insert送去構築在我所想構築的另一個Vector上。 我是這樣做的： 有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ ↓ 用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ ↓ 做失活（80度，20min） 沈澱（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH） 55度dry乾，溶ddH2O 23λ ↓ 用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下補到total:30λ ↓ 做失活（80度，20min） ↓ 跑gel 2λ (argarose，1%) 只出現一條>2000bp的band(因為我只用100bp maker) 並沒有400bp的band 註 T-A vector : 2728bp 我想請問： 1.為什麼我的insert切不下來？ 我用Sma I 、BanHI的時間都有加長 大約一倍了 也做了失活 需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊 T-A vector上也確實有Sma I 、BanHI的切位 我的inesrt也確定有接在T-A vector上（送過定序） 我該如何處理？該改進什麼地方？ 我在酵素的海報（我忘記哪間公司，好像是NETBIO） 對照時發現Sma I 、BanHI交叉點是「連續切位」 請問這是什麼意思？ 會造成digestion失敗嗎？ 2.若之後順利切下後 構築時（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？ 該注意些什麼技巧？ 專題作不出來 推徵眼看就要到 懇請善心人士幫我一下 感恩～～鞠躬～～～ -- 當人們開始盤算的時候 上天就笑了 --

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