不好意思，请高手帮帮我 1.就是我的目标基因 （insert，约400bp），接上T-A Vector， 送入E .coil中transform放大之後， 无法从T-A Vector 上切下来， 就无法把insert送去构筑在我所想构筑的另一个Vector上。 我是这样做的： 有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ ↓ 用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ ↓ 做失活（80度，20min） 沈淀（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH） 55度dry乾，溶ddH2O 23λ ↓ 用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下补到total:30λ ↓ 做失活（80度，20min） ↓ 跑gel 2λ (argarose，1%) 只出现一条>2000bp的band(因为我只用100bp maker) 并没有400bp的band 注 T-A vector : 2728bp 我想请问： 1.为什麽我的insert切不下来？ 我用Sma I 、BanHI的时间都有加长 大约一倍了 也做了失活 需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊 T-A vector上也确实有Sma I 、BanHI的切位 我的inesrt也确定有接在T-A vector上（送过定序） 我该如何处理？该改进什麽地方？ 我在酵素的海报（我忘记哪间公司，好像是NETBIO） 对照时发现Sma I 、BanHI交叉点是「连续切位」 请问这是什麽意思？ 会造成digestion失败吗？ 2.若之後顺利切下後 构筑时（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？ 该注意些什麽技巧？ 专题作不出来 推徵眼看就要到 恳请善心人士帮我一下 感恩～～鞠躬～～～ -- 当人们开始盘算的时候 上天就笑了 --

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