※ 引述《CloudTear (照片能吃嗎？口去～)》之銘言： : 不好意思，請高手幫幫我 : 1.就是我的目標基因 （insert，約400bp），接上T-A Vector， : 送入E .coil中transform放大之後， : 無法從T-A Vector 上切下來， : 就無法把insert送去構築在我所想構築的另一個Vector上。 : 我是這樣做的： : 有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ : ↓ 你的DNA濃度呢? 只取10ul的話,很可能它是有切下來的,只是切出來的band太淡了看不到 而且之後去ligation的話insert也需要多一點阿 : 用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ : ↓ : 做失活（80度，20min） : 沈澱（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH） : 55度dry乾，溶ddH2O 23λ : ↓ : 用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下補到total:30λ : ↓ : 做失活（80度，20min） : ↓ : 跑gel 2λ (argarose，1%) : 只出現一條>2000bp的band(因為我只用100bp maker) : 並沒有400bp的band 確定你的enzyme buffer有用對嗎? 定序後切點的位置有突變嗎? : 註 : T-A vector : 2728bp : 我想請問： : 1.為什麼我的insert切不下來？ : 我用Sma I 、BanHI的時間都有加長 大約一倍了 : 也做了失活 : 需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊 : T-A vector上也確實有Sma I 、BanHI的切位 : 我的inesrt也確定有接在T-A vector上（送過定序） : 我該如何處理？該改進什麼地方？ : 我在酵素的海報（我忘記哪間公司，好像是NETBIO） : 對照時發現Sma I 、BanHI交叉點是「連續切位」 : 請問這是什麼意思？ : 會造成digestion失敗嗎？ 意思就是這兩種酵素的作用溫度不同,buffer也不同,所以不能同時切 要切完一刀再切另一刀的意思 你做的方法就沒錯啦 : 2.若之後順利切下後 : 構築時（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？ : 該注意些什麼技巧？ : 專題作不出來 : 推徵眼看就要到 : 懇請善心人士幫我一下 : 感恩～～鞠躬～～～ --

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