※ 引述《CloudTear (照片能吃吗？口去～)》之铭言： : 不好意思，请高手帮帮我 : 1.就是我的目标基因 （insert，约400bp），接上T-A Vector， : 送入E .coil中transform放大之後， : 无法从T-A Vector 上切下来， : 就无法把insert送去构筑在我所想构筑的另一个Vector上。 : 我是这样做的： : 有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ : ↓ 你的DNA浓度呢? 只取10ul的话,很可能它是有切下来的,只是切出来的band太淡了看不到 而且之後去ligation的话insert也需要多一点阿 : 用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ : ↓ : 做失活（80度，20min） : 沈淀（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH） : 55度dry乾，溶ddH2O 23λ : ↓ : 用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下补到total:30λ : ↓ : 做失活（80度，20min） : ↓ : 跑gel 2λ (argarose，1%) : 只出现一条>2000bp的band(因为我只用100bp maker) : 并没有400bp的band 确定你的enzyme buffer有用对吗? 定序後切点的位置有突变吗? : 注 : T-A vector : 2728bp : 我想请问： : 1.为什麽我的insert切不下来？ : 我用Sma I 、BanHI的时间都有加长 大约一倍了 : 也做了失活 : 需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊 : T-A vector上也确实有Sma I 、BanHI的切位 : 我的inesrt也确定有接在T-A vector上（送过定序） : 我该如何处理？该改进什麽地方？ : 我在酵素的海报（我忘记哪间公司，好像是NETBIO） : 对照时发现Sma I 、BanHI交叉点是「连续切位」 : 请问这是什麽意思？ : 会造成digestion失败吗？ 意思就是这两种酵素的作用温度不同,buffer也不同,所以不能同时切 要切完一刀再切另一刀的意思 你做的方法就没错啦 : 2.若之後顺利切下後 : 构筑时（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？ : 该注意些什麽技巧？ : 专题作不出来 : 推徵眼看就要到 : 恳请善心人士帮我一下 : 感恩～～鞠躬～～～ --

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