※ 引述《LBP (幸福已經從指縫間溜走)》之銘言： : 原本我的real-time一直都做的好好的 : 結果自從有一次跑出來的Ct值忽然很低 : 之前都在28-30之間 : 那一次突然變成20上下 : 我就把real-time的產物拿去跑膠看看是哪裡有問題 : 跑出來的結果發現產物竟然不是single band... ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 不是single band的話 我會懷疑你的PCR已經有contamination的現象了 是否有的plate/tube沒有封好,在高溫的情況下PCR產物隨著蒸氣飄散在block 然後又跑到你的plate/tube裡 甚至在你prepair的時候,你所用的東西器具就已經有PCR產物的汙染了 (PCR可是很可怕的,只要一點點就可以不斷放大啊) : 可是當初作real-time之前已經用一般的PCR去跑過 : primer應該是沒問題的 : 當初跑出來也都呈現很乾淨也很sharp的single band : 竟然好像在一夕之間都做不出來了 : 於是我就回到PCR，想開始逐步找出問題所在 : 我用的cDNA都是同一批 : 起初想說先提高annealing的溫度 : 後來怎麼提高都不見改善，想說問題也許在primer : 沒想到今天把新的primer溶好後開始重P : 竟然還是無法做出當初那樣的single band : 又因為real-time需要一組internal control : 本來閉著眼睛都做的出來的internal control : 從那一次問題開始後也是無法出現single band : 連今天換了新的primer也是一樣 : 唉......好無力....已經P了一個多月 : 每天晚上一想到第二天的實驗又做不出來 : 就覺得壓力好大...心情很不好 : 我做的是hTERT基因的表現 : 請問也有人在做這個的嗎? 我看到這裡,覺得比較像環境上的污染而非機器污染 如果是我,我會連pipetteman都仔細清過(用酒精擦拭,恐怕連內管都要處理一下), tip也改用filter tip... 不果我想問一下,你跑膠出來的結果不是single band而是怎樣的情況啊? 是多一條band? 還是變成smear? 如果是多一條band,而且在hTERT跟internal control都有一樣大的band出現 那我的推測應該就獲得證實了... 希望可以幫上忙,也歡迎討論. --

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