※ 引述《LBP (幸福已经从指缝间溜走)》之铭言： : 原本我的real-time一直都做的好好的 : 结果自从有一次跑出来的Ct值忽然很低 : 之前都在28-30之间 : 那一次突然变成20上下 : 我就把real-time的产物拿去跑胶看看是哪里有问题 : 跑出来的结果发现产物竟然不是single band... ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 不是single band的话 我会怀疑你的PCR已经有contamination的现象了 是否有的plate/tube没有封好,在高温的情况下PCR产物随着蒸气飘散在block 然後又跑到你的plate/tube里 甚至在你prepair的时候,你所用的东西器具就已经有PCR产物的污染了 (PCR可是很可怕的,只要一点点就可以不断放大啊) : 可是当初作real-time之前已经用一般的PCR去跑过 : primer应该是没问题的 : 当初跑出来也都呈现很乾净也很sharp的single band : 竟然好像在一夕之间都做不出来了 : 於是我就回到PCR，想开始逐步找出问题所在 : 我用的cDNA都是同一批 : 起初想说先提高annealing的温度 : 後来怎麽提高都不见改善，想说问题也许在primer : 没想到今天把新的primer溶好後开始重P : 竟然还是无法做出当初那样的single band : 又因为real-time需要一组internal control : 本来闭着眼睛都做的出来的internal control : 从那一次问题开始後也是无法出现single band : 连今天换了新的primer也是一样 : 唉......好无力....已经P了一个多月 : 每天晚上一想到第二天的实验又做不出来 : 就觉得压力好大...心情很不好 : 我做的是hTERT基因的表现 : 请问也有人在做这个的吗? 我看到这里,觉得比较像环境上的污染而非机器污染 如果是我,我会连pipetteman都仔细清过(用酒精擦拭,恐怕连内管都要处理一下), tip也改用filter tip... 不果我想问一下,你跑胶出来的结果不是single band而是怎样的情况啊? 是多一条band? 还是变成smear? 如果是多一条band,而且在hTERT跟internal control都有一样大的band出现 那我的推测应该就获得证实了... 希望可以帮上忙,也欢迎讨论. --

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