※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : ※ 引述《LBP (幸福已經從指縫間溜走)》之銘言： : : 原本我的real-time一直都做的好好的 : : 結果自從有一次跑出來的Ct值忽然很低 : : 之前都在28-30之間 : : 那一次突然變成20上下 : : 我就把real-time的產物拿去跑膠看看是哪裡有問題 : : 跑出來的結果發現產物竟然不是single band... : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : 不是single band的話 : 我會懷疑你的PCR已經有contamination的現象了 : 是否有的plate/tube沒有封好,在高溫的情況下PCR產物隨著蒸氣飄散在block : 然後又跑到你的plate/tube裡 : 甚至在你prepair的時候,你所用的東西器具就已經有PCR產物的汙染了 : (PCR可是很可怕的,只要一點點就可以不斷放大啊) 嗯...你說的這個情況我想暫時是可以排除的 我使用的是ABI原廠8tubes per strip 蓋上caps時也是用它專用的黑棒棒(不知道這個叫什麼^^") 所以密封度我想是沒問題的 另外我忘了提到 原本都做的出來的real-time，開始出現問題後 我repeat了好幾次都一直出現相同的問題--過低的Ct值以及雜band的電泳結果 此外，原文mandible推文提及我原本所謂有做出來的Ct值 是否過高(28-30) 我想應該是還在可以接受的範圍內 因為欲增幅的這個片段在一開始的PCR結果中表現就已經偏弱了 於是在real-time會得到偏高的Ct值，我個人覺得是合理的 (如果這樣的想法有誤請給予指正 ^^" ) : 我看到這裡,覺得比較像環境上的污染而非機器污染 : 如果是我,我會連pipetteman都仔細清過(用酒精擦拭,恐怕連內管都要處理一下), : tip也改用filter tip... : 不果我想問一下,你跑膠出來的結果不是single band而是怎樣的情況啊? : 是多一條band? 還是變成smear? : 如果是多一條band,而且在hTERT跟internal control都有一樣大的band出現 : 那我的推測應該就獲得證實了... : 希望可以幫上忙,也歡迎討論. 我想你的推測應該是對了 因為我今天仔細看著之前的電泳圖 發現前幾次的結果中，hTERT跟internal control隱約有著一樣大小的雜band 然後今天重新換了reaction buf.和dNTP也是出現雜band 我目前是想說可能連最根本的水是污染的 剛剛重新用新拆封的水去稀釋cDNA和primer 希望明天可以看到漂亮的data >_< 要是再出不來我也束手無策了吧 T__T --

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