※ 引述《rpr (Cathy)》之铭言： : ※ 引述《LBP (幸福已经从指缝间溜走)》之铭言： : : 原本我的real-time一直都做的好好的 : : 结果自从有一次跑出来的Ct值忽然很低 : : 之前都在28-30之间 : : 那一次突然变成20上下 : : 我就把real-time的产物拿去跑胶看看是哪里有问题 : : 跑出来的结果发现产物竟然不是single band... : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : 不是single band的话 : 我会怀疑你的PCR已经有contamination的现象了 : 是否有的plate/tube没有封好,在高温的情况下PCR产物随着蒸气飘散在block : 然後又跑到你的plate/tube里 : 甚至在你prepair的时候,你所用的东西器具就已经有PCR产物的污染了 : (PCR可是很可怕的,只要一点点就可以不断放大啊) 嗯...你说的这个情况我想暂时是可以排除的 我使用的是ABI原厂8tubes per strip 盖上caps时也是用它专用的黑棒棒(不知道这个叫什麽^^") 所以密封度我想是没问题的 另外我忘了提到 原本都做的出来的real-time，开始出现问题後 我repeat了好几次都一直出现相同的问题--过低的Ct值以及杂band的电泳结果 此外，原文mandible推文提及我原本所谓有做出来的Ct值 是否过高(28-30) 我想应该是还在可以接受的范围内 因为欲增幅的这个片段在一开始的PCR结果中表现就已经偏弱了 於是在real-time会得到偏高的Ct值，我个人觉得是合理的 (如果这样的想法有误请给予指正 ^^" ) : 我看到这里,觉得比较像环境上的污染而非机器污染 : 如果是我,我会连pipetteman都仔细清过(用酒精擦拭,恐怕连内管都要处理一下), : tip也改用filter tip... : 不果我想问一下,你跑胶出来的结果不是single band而是怎样的情况啊? : 是多一条band? 还是变成smear? : 如果是多一条band,而且在hTERT跟internal control都有一样大的band出现 : 那我的推测应该就获得证实了... : 希望可以帮上忙,也欢迎讨论. 我想你的推测应该是对了 因为我今天仔细看着之前的电泳图 发现前几次的结果中，hTERT跟internal control隐约有着一样大小的杂band 然後今天重新换了reaction buf.和dNTP也是出现杂band 我目前是想说可能连最根本的水是污染的 刚刚重新用新拆封的水去稀释cDNA和primer 希望明天可以看到漂亮的data >_< 要是再出不来我也束手无策了吧 T__T --

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