我是使用 roche 的DIG操作 (很多東西是我自己泡的 不能泡才用買的) 我的問題是 我連free probe都看不到 不是髒就是一片白 (我有確定沒有跳海) 首先我做Dot Blot確定我的dig-label是沒有問題的 可能跑膠後的面步驟有問題 我的步驟如下 希望各位先進可以指點一下 1. gel component: 5X TBE buffer 1ml 40% AC 1.5ml DD water 7.4ml 10% APS 100 ul TEMED 10 ul total 10ml 我是再跑膠的隔天就先做好膠預備 做好後加0.5X TBE 保鮮膜覆蓋 4度冰箱保存 2. (running buffer:0.5X TBE) 跑膠前 pre-run 30min以上 80 V (福特數會不會太小? 我後來看了promega的好像是用350V 但他是用isotope) 3. 因為我的binding buffer沒有glycerol 因此 sample我都各 + 2 ul glycerol (my binding buffer:100mM Hepes ph7.6, 5mM EDTA, 50mM (NH4)2SO4 5mM DTT, Tween 20 1% w/v, 150mM KCl ) roche的protocol中有建議的loading buffer 但是 我之前跑出來的膠更奇怪 sample+loading buffer跑出來的膠well兩側有被拖曳的現象 故改用只加 glycerol 跑膠時 在空well中加loading buffer 另一加protein Marker 都沒有被拖曳的現象 4.待sample跑入well中 就移進cold room去跑膠 未跳海前切除電源 馬上transfer 大約要1.5hr 降會不會太久? 是否該調快減少時間?? 5.(Tranfer buffer :0.5X TBE) semi-dry 30mA 30V 60min /片 (一次只做一片) 6.oligonucleotides crosslinker: UV stratalinker 1200mJ (我有用Whatman 的濾紙 浸泡2x SCC buffer 襯在membrane下方) 7. washing buffer wash 3min -> 1X blocking RT 30min -> anti-dig AP 1000x in 1X blocking solution RT 30 min -> washing buffer wash 10min 兩次 -> CSPD (37 degree developing 10min) -> x-ray film exposure 10~30分鐘不等 (我有試過blocking 4度 over night 比較乾淨 但是一樣 no band, no free probe) 請問大家 我的步驟哪裡錯了嗎? 還是哪裡可以在修正 請告訴我 感謝~~ 另外 我想請問一下 1.dig label後 要怎麼保存 -80 度 分裝保存嗎? 可以放多久?? 2.我的probe 很短只有20mer 會影響結果嗎?? 3.如何confirm DNA是double-strand ?? 跑膠 看EtBr有沒有卡進去??這是我幻想的 拜託 ~~~謝謝大家 -- 有些事情 不知道 是幸福的 你說呢 ? --

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