我是使用 roche 的DIG操作 (很多东西是我自己泡的 不能泡才用买的) 我的问题是 我连free probe都看不到 不是脏就是一片白 (我有确定没有跳海) 首先我做Dot Blot确定我的dig-label是没有问题的 可能跑胶後的面步骤有问题 我的步骤如下 希望各位先进可以指点一下 1. gel component: 5X TBE buffer 1ml 40% AC 1.5ml DD water 7.4ml 10% APS 100 ul TEMED 10 ul total 10ml 我是再跑胶的隔天就先做好胶预备 做好後加0.5X TBE 保鲜膜覆盖 4度冰箱保存 2. (running buffer:0.5X TBE) 跑胶前 pre-run 30min以上 80 V (福特数会不会太小? 我後来看了promega的好像是用350V 但他是用isotope) 3. 因为我的binding buffer没有glycerol 因此 sample我都各 + 2 ul glycerol (my binding buffer:100mM Hepes ph7.6, 5mM EDTA, 50mM (NH4)2SO4 5mM DTT, Tween 20 1% w/v, 150mM KCl ) roche的protocol中有建议的loading buffer 但是 我之前跑出来的胶更奇怪 sample+loading buffer跑出来的胶well两侧有被拖曳的现象 故改用只加 glycerol 跑胶时 在空well中加loading buffer 另一加protein Marker 都没有被拖曳的现象 4.待sample跑入well中 就移进cold room去跑胶 未跳海前切除电源 马上transfer 大约要1.5hr 降会不会太久? 是否该调快减少时间?? 5.(Tranfer buffer :0.5X TBE) semi-dry 30mA 30V 60min /片 (一次只做一片) 6.oligonucleotides crosslinker: UV stratalinker 1200mJ (我有用Whatman 的滤纸 浸泡2x SCC buffer 衬在membrane下方) 7. washing buffer wash 3min -> 1X blocking RT 30min -> anti-dig AP 1000x in 1X blocking solution RT 30 min -> washing buffer wash 10min 两次 -> CSPD (37 degree developing 10min) -> x-ray film exposure 10~30分钟不等 (我有试过blocking 4度 over night 比较乾净 但是一样 no band, no free probe) 请问大家 我的步骤哪里错了吗? 还是哪里可以在修正 请告诉我 感谢~~ 另外 我想请问一下 1.dig label後 要怎麽保存 -80 度 分装保存吗? 可以放多久?? 2.我的probe 很短只有20mer 会影响结果吗?? 3.如何confirm DNA是double-strand ?? 跑胶 看EtBr有没有卡进去??这是我幻想的 拜托 ~~~谢谢大家 -- 有些事情 不知道 是幸福的 你说呢 ? --

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