作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)
看板Biotech
標題Re: [問題] cloning
時間Thu Nov 2 03:14:35 2006
※ 引述《hurp (修身齊家治國賺大錢)》之銘言：
: 小弟的cloning 算是比較土法鍊鋼的, 提出來跟大家討論一下.
你的方法是分生的基礎....實驗室功力很扎實喔
: 我基本上是做PCR subcloning, insert大小從1kb~3kb不等.
: 通常是用pfu, 30 cycle. 前題是PCR確定能work, 並盡量減少
: template的量.一個sample跑兩管PCR, 這樣子PCR product比較多.
: 把兩管PCR product收集在一起,
: 加入1/10體積的3M Na-Acetate,
: 再加入10倍體積的純乙醇, 置於室溫15分鐘
建議你放零下20度沈澱效果更好
: 室溫離心, 14000rpm, 15分鐘, 結束後應該可以看到有白色沉澱
: 倒掉上清液, 用70%酒精清洗沉澱物, 再離心, 去掉酒精
: 白色沉澱完全乾燥後, 用30 micro-liter的水回溶.
如果DNA夠濃建議用TE，保存久又穩定，如果你要立刻切用水無訪
: 把回溶的PCR產物全部拿去做enzyme digestion (我的primer有設計RE site), overnight
: 第二天把sample進行gel extraction, PCR product的量應該是很夠"消耗"的了.
: 土法鍊鋼, 見笑了, 不過我用得還挺順手的,而且很適合經費短缺的Lab...唉...
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◆ From: 210.58.54.177
1F：推 hurp:謝謝前輩的指點,感恩囉! 11/02 13:01
2F：推 jazzdevil:但如果之後是要送定序的話..建議溶水比較好.. 11/04 03:34