作者Mouseking (叫我老鼠王....-_-)
看板Biotech
标题Re: [问题] cloning
时间Thu Nov 2 03:14:35 2006
※ 引述《hurp (修身齐家治国赚大钱)》之铭言：
: 小弟的cloning 算是比较土法链钢的, 提出来跟大家讨论一下.
你的方法是分生的基础....实验室功力很扎实喔
: 我基本上是做PCR subcloning, insert大小从1kb~3kb不等.
: 通常是用pfu, 30 cycle. 前题是PCR确定能work, 并尽量减少
: template的量.一个sample跑两管PCR, 这样子PCR product比较多.
: 把两管PCR product收集在一起,
: 加入1/10体积的3M Na-Acetate,
: 再加入10倍体积的纯乙醇, 置於室温15分钟
建议你放零下20度沈淀效果更好
: 室温离心, 14000rpm, 15分钟, 结束後应该可以看到有白色沉淀
: 倒掉上清液, 用70%酒精清洗沉淀物, 再离心, 去掉酒精
: 白色沉淀完全乾燥後, 用30 micro-liter的水回溶.
如果DNA够浓建议用TE，保存久又稳定，如果你要立刻切用水无访
: 把回溶的PCR产物全部拿去做enzyme digestion (我的primer有设计RE site), overnight
: 第二天把sample进行gel extraction, PCR product的量应该是很够"消耗"的了.
: 土法链钢, 见笑了, 不过我用得还挺顺手的,而且很适合经费短缺的Lab...唉...
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.58.54.177
1F：推 hurp:谢谢前辈的指点,感恩罗! 11/02 13:01
2F：推 jazzdevil:但如果之後是要送定序的话..建议溶水比较好.. 11/04 03:34