各位好 我現在是用 人類細胞株中抽取的 genomic DNA 當作 template 進行 PCR 想要 P 出一段長度約 3 K 的 promoter region 之前可能因為 primer 沒有設計好 一直 P 不出來 重新設計 primer 後 是可以在正確位置看得到 band 可是 不管怎麼改變 annealing 的溫度 或 DNA template 的量.. 甚至是增加 cycle 數 (35 --> 40) 都沒有辦法讓這 band 的 signal 強一點 量一直都非常少.... 我的 PCR condition 如下: 98 ℃, 3 min 98 ℃ 1 min 61.0 or 58.0 ℃ 40 sec 72 ℃ 3 min ×35 or 40 72 ℃ 10 min 4 ℃ ∞ DNA template 的量 則是從 3 ng --> 2 ug 都試過了 不是 P 不出 就是只有微弱的 band Primer 則 FW RV 各加 100ng 要提到的是 因為是 promoter region 兩個 primer 都有 GC-rich 的情況 FW 還好 ( 55 %) 但 RV 的 GC 高達 66.67 % 不知道這是否影響了我 PCR 的產率? 還是 DNA template 不夠乾淨?? 或說這樣的 PCR 還有什麼需要特別留意的地方?? 謝謝各位的指教~~謝謝!! -- 白天不懂夜的黑 太陽不解月的悲 --

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