作者Katoh (人工智慧)
看板Biotech
標題[問題] TA cloning
時間Wed Nov 15 23:45:37 2006
版上的高手大家好 有問題想請教大家
我的insert是primer有設計RE的PCR product(2.8k)
質體是pGEX-2TK(4.9k)
這陣子做cloning試了好幾次
(兩種RE insert跟plasmid分別各切4hr後
用gel extraction分別純化後在ligation 16hr)
最後挑出來的菌去抽質體都是原始質體
因此想改用TA cloning先接上去之後再切
但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有
(分別是SmaI&EcoRI)
跟vector上的切口還蠻接近的 不知道這樣會不會有影響
還有一點請教大家
就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是鄰近的兩個切口
GGATC
CCCGGGAATTCATCG (黃色是SmaI 紅色是EcoRI)
CCTAG
GGGCCCTTAAGTAGC (綠色的base兩個RE都有用到)
(不知道畫這樣看不看的懂)
是否可能因為太靠近導致vector其實只切了一邊的刀口
所以後續ligation失敗
謝謝大家
順便請問大家哪家的TA cloning比較好用呢?
問題有點多 真不好意思 再次感謝!
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◆ From: 140.123.127.44
※ 編輯: Katoh 來自: 140.123.127.44 (11/15 23:53)
1F：推 aggaci:兩個切位太近要分兩次切，smaI本來就不好切了兩個切位太近 11/15 23:57
2F：→ aggaci:又更難切了，話說回來smaI和EcoRI作用溫度不是不同嗎? 11/15 23:59
3F：→ aggaci:你怎麼一起切的哩 11/16 00:00
4F：推 Katoh:我是分兩次切的沒錯 兩種RE各切4hr 沒說清楚真是不好意思 11/16 00:08
5F：推 aggaci:cleavaged plasmid有加CIP處理過嗎 11/16 00:26
6F：→ aggaci:我是很想建議你不要用smaI啦......orz.. 11/16 00:28
7F：推 Katoh:因為2TK的MCS只有BamHI&EcoRI&SmaI 然後insert中間有BamHI囧 11/16 00:29
9F：推 Katoh:我是先SmaI失活後再EcoRI 所以切質體應該不會有樓上的問題 11/16 01:02
10F：→ Katoh:insert的primer的話SmaI切口外我有多三個base EcoRI多兩個 11/16 01:04
11F：推 Katoh:primer多了base還可能切不乾淨所以我才想改試TA cloning :( 11/16 01:09
12F：→ Katoh:我cleavaged plasmid沒有加CIP orz所以我應該先用原本的方法 11/16 01:11
13F：→ Katoh:做insert然後質體加CIP先試試看嗎? 11/16 01:12
14F：推 ROKEE:SmaI很好用阿.. @_@ 11/16 11:55
15F：推 aggaci:是地~ 11/16 13:25