作者Katoh (人工智慧)
看板Biotech
标题[问题] TA cloning
时间Wed Nov 15 23:45:37 2006
版上的高手大家好 有问题想请教大家
我的insert是primer有设计RE的PCR product(2.8k)
质体是pGEX-2TK(4.9k)
这阵子做cloning试了好几次
(两种RE insert跟plasmid分别各切4hr後
用gel extraction分别纯化後在ligation 16hr)
最後挑出来的菌去抽质体都是原始质体
因此想改用TA cloning先接上去之後再切
但是我primer上面的RE在PCR cloning vector也有
(分别是SmaI&EcoRI)
跟vector上的切口还蛮接近的 不知道这样会不会有影响
还有一点请教大家
就是pGEX-2TK上面SmaI&EcoRI是邻近的两个切口
GGATC
CCCGGGAATTCATCG (黄色是SmaI 红色是EcoRI)
CCTAG
GGGCCCTTAAGTAGC (绿色的base两个RE都有用到)
(不知道画这样看不看的懂)
是否可能因为太靠近导致vector其实只切了一边的刀口
所以後续ligation失败
谢谢大家
顺便请问大家哪家的TA cloning比较好用呢?
问题有点多 真不好意思 再次感谢!
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◆ From: 140.123.127.44
※ 编辑: Katoh 来自: 140.123.127.44 (11/15 23:53)
1F：推 aggaci:两个切位太近要分两次切，smaI本来就不好切了两个切位太近 11/15 23:57
2F：→ aggaci:又更难切了，话说回来smaI和EcoRI作用温度不是不同吗? 11/15 23:59
3F：→ aggaci:你怎麽一起切的哩 11/16 00:00
4F：推 Katoh:我是分两次切的没错 两种RE各切4hr 没说清楚真是不好意思 11/16 00:08
5F：推 aggaci:cleavaged plasmid有加CIP处理过吗 11/16 00:26
6F：→ aggaci:我是很想建议你不要用smaI啦......orz.. 11/16 00:28
7F：推 Katoh:因为2TK的MCS只有BamHI&EcoRI&SmaI 然後insert中间有BamHI囧 11/16 00:29
9F：推 Katoh:我是先SmaI失活後再EcoRI 所以切质体应该不会有楼上的问题 11/16 01:02
10F：→ Katoh:insert的primer的话SmaI切口外我有多三个base EcoRI多两个 11/16 01:04
11F：推 Katoh:primer多了base还可能切不乾净所以我才想改试TA cloning :( 11/16 01:09
12F：→ Katoh:我cleavaged plasmid没有加CIP orz所以我应该先用原本的方法 11/16 01:11
13F：→ Katoh:做insert然後质体加CIP先试试看吗? 11/16 01:12
14F：推 ROKEE:SmaI很好用阿.. @_@ 11/16 11:55
15F：推 aggaci:是地~ 11/16 13:25